蛋白質(zhì)分離技術(shù)

1、第十節(jié),蛋白質(zhì)的分離與純化,一、 引言二、 蛋白質(zhì)（酶）分離純化的前處理三、蛋白質(zhì)（酶）分離與純化四、層析技術(shù)五、電泳技術(shù)六、離心技術(shù),四、層析技術(shù),層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。194

2、4年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、氣相層析、高壓液相層析、親和層析、凝膠層析等。,（一）層析的分類,按層析的分離機(jī)理分類排阻層析(exclusion chromatography)離子交換層析(ion exchange chromatography)吸附層析(absorption chromatography)分配層析(partition chromatography)親和層析(affinity chro

3、matography)金屬螯合層析(metal chelating chromatography)疏水層析(hydrophobic chromatography)反向?qū)游?reverse phase chromatography)聚焦層析(focusing chromatography)灌注層析(perfusion chromatography),（二）排阻層析 （凝膠層析）,凡是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量差異進(jìn)行層析分離的

4、方法，均稱之為排阻層析。用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)。凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥的研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。,1、凝膠層析的特點及應(yīng)用,特點：設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點。用途：蛋白質(zhì)(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃

5、縮等。,2、凝膠層析的原理,凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移

6、動速度較慢，最后被洗脫出來。,,,3. 凝膠的種類和性質(zhì),(1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex) 1) Sephadex G G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。 G 反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。 2） SephadeX LH—20，是Sephadex G—25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。(2)瓊脂糖凝膠（Sepharose ; pharmacia;B

7、io-Gel(Blo-Rad) 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。(3)聚丙烯酰胺 一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。 商品名為生物膠—P（Bio-Gel P).(4) 聚丙乙烯凝膠（Styrogel) 大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。,葡聚糖凝膠(Sephadex )的物理特性,4. 層析柱的重要參數(shù),⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱

8、的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt 表示。 ⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。,⑶內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。 不包括固體支持物的體積（Vg）。 ⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液的體積，常用Ve 表示。當(dāng)

9、使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。 當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。,,5. 凝膠過濾在試驗室中的應(yīng)用,1）生物大分子物質(zhì)的分離純化2）分子量的測定3）分級分離4）溶液濃縮5）平衡常數(shù)的測定6）細(xì)胞及顆粒的分離,6. 分子量的測定,蛋

10、白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):,LogM=k1-k2Ve,（Ve為洗脫體積）,先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。,（三）離子交換層析,根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團(tuán)。含有酸性可解離基團(tuán)的稱為陽離子交換樹脂，可解離出H+；含有堿性可解離

11、基團(tuán)的稱為陰離子交換樹脂，可解離出OH-。,1.離子交換層析的原理,生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等多價電解質(zhì)有不同的分子大小及電荷排列方式。 當(dāng)在一定pH下凈電荷為負(fù)的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到帶正電荷的陰離子交換劑上； 當(dāng)在一定pH下凈電荷為正的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到帶負(fù)電荷的陽離子交換劑上； 大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而在以不同牢度被吸附于離子交換劑，通過改變離子強(qiáng)度或(和)pH使大分子

12、再從離子交換劑上先后被洗脫下來。,,,2. 離子交換層析的應(yīng)用,1)水處理 離子交換層析是一種簡單而有效的雜質(zhì)及各種離子的方法，聚丙乙烯樹脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。2)分離純化小分子物質(zhì) 離子交換層析廣泛應(yīng)用于無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。例如對氨基酸的分析使用強(qiáng)酸性陽離子聚苯乙烯樹脂，將氨基酸混合液在pH值為2～3上柱。這時氨基酸都結(jié)合在樹脂上，

13、再逐步提高洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，可以進(jìn)行分離鑒定。全自動氨基酸分析儀就是采用這種原理制成。,3)分離純化生物大分子物質(zhì) 離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來進(jìn)行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。 由于生物樣品的復(fù)雜性，一般很難只經(jīng)過一次離子交換層析就達(dá)到高純度，往往要與其它分離方法結(jié)合使用。 使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶

14、電性質(zhì)來分離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到較滿意的分離效果。,（四）吸附層析(absorption chromatography),吸附作用是指某些物質(zhì)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。 利用吸附層析介質(zhì)表面的活性分子或活性基團(tuán)，對流動相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對不同溶質(zhì)吸附能力的強(qiáng)弱而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為吸附層析。固定相為固體，流動相為液體。,物質(zhì)之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分

15、子和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不同。在固體內(nèi)部，分子之間互相作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處于固體表明的分子所收的力是不對稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，稱為吸附

16、平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡和不平衡、吸附與解吸的動態(tài)平衡過程。,實驗中常用的固體吸附劑有氧化鋁、硅酸鎂、磷酸鈣、氫氧化鈣、活性鈣、蔗糖、纖維素和淀粉。常用的洗脫液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水與有機(jī)溶劑形成的各種混合物。吸附層析通常用于分離脂類、類固醇類、類胡羅卜素、葉綠素以及它們的前體等非極性和極性不強(qiáng)的有機(jī)物。,（五）分配層析(partition chromatography),分配層析是利用混合物中各組

17、分在兩相中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的層析技術(shù)，相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑抽提方法。 在分配層析中，固定相是極性溶劑（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此類溶劑能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素粉，濾紙等)緊密結(jié)合，使呈不流動狀態(tài)；流動相則是非極性的有機(jī)溶劑。,分配系數(shù)(α)是指在一定溫度和壓力條件下達(dá)到平衡，物質(zhì)在固定相和流動相兩部分的濃度比值。,在層析過程中，當(dāng)有機(jī)溶劑流動相流經(jīng)樣品點時，樣品中的溶質(zhì)便按其分

18、配系數(shù)部分地轉(zhuǎn)入流動相向前移動。當(dāng)經(jīng)過前方固定相時，流動相中的溶質(zhì)就會進(jìn)行分配，一部分進(jìn)入固定相。通過這樣不斷進(jìn)行的流動和再分配，溶質(zhì)沿著流動方向不斷前進(jìn)。各種溶質(zhì)由于分配系數(shù)不同，向前移動的速度也各不相同。分配系數(shù)較大的物質(zhì)，由于分配在固定相多些，分配在流動相少些，溶質(zhì)移動較慢；而分配系數(shù)較小的物質(zhì)，流動速度較快。從而將分配系數(shù)不同的物質(zhì)分離開來。,,,（六）親和層析(Affinity Chromatography),許多物質(zhì)都具有

19、和某化合物發(fā)生特異性可逆結(jié)合的特性。例如：酶與輔酶或酶與底物（產(chǎn)物或競爭性抑制劑等），抗原與抗體，凝集素與受體，維生素與結(jié)合蛋白，凝集素與多糖（或糖蛋白、細(xì)胞表面受體），核酸與互補(bǔ)鏈（或組蛋白、核酸多聚酶、結(jié)合蛋白）以及細(xì)胞與細(xì)胞表面特異蛋白（或凝集素）等。,1. 親和層析的原理,親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時

20、，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的目的 。,,,,配體,蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物,,,,,,2. 親和層析的特點,純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，所以分離提純的效率極高，提純度可達(dá)幾千倍 。,3. 親和層析的應(yīng)用,1） 抗原和抗體  利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進(jìn)行分離的方法又稱

21、為免疫親和層析。例如將抗原結(jié)合于親和層析基質(zhì)上，就可以從血清中分離其對應(yīng)的抗體?？乖?、抗體間親和力一般比較強(qiáng)，其解離常數(shù)為10–8 - 10–12 M，所以洗脫時是比較困難的，通常需要較強(qiáng)烈的洗脫條件。,2) 激素和受體蛋白  激素的受體蛋白屬于膜蛋白，利用去污劑溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性質(zhì)，難于用通常的層析技術(shù)分離。但去污劑溶解通常不影響受體蛋白與其對應(yīng)激素的結(jié)合。所以利用激素和受體蛋白間的高親和力（10-6－1

22、0–12 M）而進(jìn)行親和層析是分離受體蛋白的重要方法。目前已經(jīng)用親和層析方法純化出了大量的受體蛋白，如乙酰膽堿、腎上腺素、生長激素、嗎啡、胰島素等等多種激素的受體。,3) 凝集素和糖蛋白  凝集素是一類具有多種特性的糖蛋白，幾乎都是從植物中提取。它們能識別特殊的糖，因此可以用于分離多糖、各種糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細(xì)胞。用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。 伴刀豆球蛋白A能結(jié)合含

23、α-D-吡喃甘露糖苷或α -D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。 麥胚凝集素可以特異的與N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)合，可以用于血型糖蛋白A、紅細(xì)胞膜凝集素受體等的分離。洗脫時只需用相應(yīng)的單糖或類似物，就可以將待分離的糖蛋白洗脫下來。,4）多核苷酸和核酸  利用poly-U作為配體可以用于分離mRNA以及各種poly-U結(jié)合蛋白。poly-A可以用于分離RNA聚合酶以及其它poly-A結(jié)合蛋白。以DNA作為

24、配體可以用于分離各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多種酶類。5）輔酶  核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子，利用它們與對應(yīng)酶的親和力可以對多種酶類進(jìn)行分離純化。例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等應(yīng)用很廣泛，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。,6）分離病毒、細(xì)胞  利用配體與病毒、細(xì)胞表面受體的相互

25、作用，親和層析也可以用于病毒和細(xì)胞的分離。利用凝集素、抗原、抗體等作為配體都可以用于細(xì)胞的分離。 例如各種凝集素可以用于分離紅細(xì)胞以及各種淋巴細(xì)胞，胰島素可以用于分離脂肪細(xì)胞等。,（七）金屬螯合層析(metal chelating chromatography),利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特

26、異螯合作用而進(jìn)行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。,金屬螯合層析技術(shù)在現(xiàn)代基因工程中常用于表達(dá)蛋白的分離,▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁,（八）高效液相色譜（ HPLC ）,高效液相色譜法是以液體作為流動相，用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%

27、則需用高效液相色譜來分析。,1. 高效液相色譜法的特點,特點：高壓、高效、高速 高沸點、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。,2. 液相色譜儀、主要部件及流程,,,,主要部件,(1) 高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。,(2) 梯度淋洗裝置,外

28、梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,(3) 進(jìn)樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：,(4) 高效分離柱,柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6 mm，柱長5～40 cm。發(fā)展趨勢是減小填

29、料粒度和柱徑以提高柱效。,(5) 高效液相色譜檢測器,紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。 最常用的檢測器。,光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,3. 影響分離的因素,影響分離的主要因素有: 固定相及分離柱； 流動相的流量、性質(zhì)和極性;,1）固定相及

30、分離柱,選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。 選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度； 研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。,2）流動相及流動相的極性,（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。 液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正

31、相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,流動相組成,流動相按組成不同可分為單組分和多組分； 按極性可分為極性、弱極性、非極性； 按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或

32、增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。,4. 高效液相色譜法的主要分離類型,1）吸附色譜（液-固吸附色譜） 以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2）分配色譜（液-液分配色譜） 早期通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相, 現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。,3）離子交換色譜

33、 固定相為離子交換樹脂，流動相為無機(jī)酸或無機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。4）凝膠色譜（空間排阻色譜） 以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；,五、電泳技術(shù),電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophore

34、sis）。電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學(xué)家Re?ss進(jìn)行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。,電泳技術(shù)發(fā)展簡史,1809年俄國物理學(xué)家Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層

35、變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現(xiàn)象。  1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。,1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的

36、開拓性貢獻(xiàn)而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎。  1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進(jìn)行過研究。1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。,1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提

37、高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代。50多年來，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是檢驗生化物質(zhì)的最高純度：即“電泳純”（一維電泳一條帶或二維電泳一個點）的標(biāo)準(zhǔn)分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對生物大分子進(jìn)行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段，即“Last Check”。80年代發(fā)展起來的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受

38、到人們的充分重視和應(yīng)用。,（一）電泳的分類,原則上按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。,按支持介質(zhì)種類的

39、不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。,③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量

40、相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì),（二）電泳的基本原理,電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動，不同的物質(zhì)在一定的電場強(qiáng)度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力

41、不同，向相反電極泳動速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的。,若將帶凈電荷Q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為： F引= E Q （1）在溶液中,運動粒子與溶液之間存在阻力F阻 F阻= 6πrηV 當(dāng)F引=F阻時 EQ = 6πrηV V =

42、 由上式可以看出,粒子的移動速度(泳動速度V)與電場強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀有關(guān)。,EQ,6πrη,,（2）,（3）,（4）,由（4）可知，帶電粒子的泳動速度受電場強(qiáng)度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同。 在一次電泳中，蛋白質(zhì)處在同一電場中，為了便于比

43、較，常用遷移率 m（或稱泳動度，指帶電粒子在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度）代替泳動速度表示粒子的泳動情況。 m = V/E = Q/6πrη （5） 由上式可以看出，在同一電場中，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量、粒子大小及溶液粘度有關(guān)，而與電場強(qiáng)度無關(guān)。,EQ,6πrη,（4）,,V=,以上討論的是在溶液中進(jìn)行的自由界面電泳的情況，在用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電滲（是指在

44、電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。電泳時應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。 最后要考慮選用離子強(qiáng)度適宜的溶液。離子強(qiáng)度影響粒子的電動電勢，溶液的離子強(qiáng)度越高，由于溶液中的離子會分擔(dān)大部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢，反之越快。 總之，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強(qiáng)度多種因素的影響。,（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳,?聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryla

45、mide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。?聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑作用下合成的。?聚丙烯酰胺凝

46、膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。,丙烯酰胺,N, N’-甲叉雙丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,1. 聚丙烯酰胺凝膠的制備,聚丙烯酰胺凝膠聚合為自由基聚合，其催化體系有兩種： 1.化學(xué)聚合 化學(xué)聚合的催化劑（引發(fā)劑）通常采用過硫酸銨（ammonium persulfate，Ap），此外還需要加速劑TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二

47、胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可促使過硫酸銨形成自由基： S2O82- 2?SO4- 這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。,,2.光聚合,光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響： （1

48、）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。 （2）低溫、低pH都會減慢聚合反應(yīng)速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。,2. 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系,凝膠的物理性質(zhì)如機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）

49、的計算公式分別為：,凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%時，凝膠具有最小孔徑，超過5%或低于5%時凝膠孔徑都要增大。,在濃度為7.5% 的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5% 凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對于一個未知樣品，常用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10% 的凝膠梯度來測試，而后選出適

50、宜的凝膠濃度。用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%的大孔凝膠，此時凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖，或在3%凝膠中加入20%蔗糖以增加機(jī)械強(qiáng)度而又不影響凝膠孔徑大小。,3. 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面： 1）凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠（2~3％），下層為小孔徑的分離膠（ 5~15％ ）。 2）緩沖液離子組成的不連續(xù)性。主要是陰離子不同（Gly-

51、, Cl-）。 3）凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9 的Tris-HCl緩沖液。 4）在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。 在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。,,,,,,,Tris-Gly pH=8.3,Tris-Gly

52、pH=8.3,Tris-HCl pH=6.8T=3%,Tris-HCl pH=8.9T=7.5%,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4. SDS聚丙

53、烯酰胺凝膠電泳電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。當(dāng)電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。,SDS的作用原理,這種陰離子去污劑能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)分子部、分子之間以及與其它物質(zhì)分子

54、之間的非共價鍵,使蛋白質(zhì)變性而改變原有的空間構(gòu)象。 當(dāng)SDS的總量為蛋白量的3～10倍且SDS單位濃度大于1mol./L時，這兩者的結(jié)合是定量的，大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.4克SDS。 蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的SDS陰離子，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有電荷量，從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間電荷符號的差異。且由于分子量越大的蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS越多，所帶負(fù)電荷也越多，這就使各蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的電荷密度趨于一致。,不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)

55、合物形狀相似，均是長橢球狀。 在電泳過程中，遷移率僅取決于蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的大小，也可以說是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，而與蛋白質(zhì)原來所帶電荷量無關(guān)。 m = V/E = Q/6πrη 令： Q/η = C 則： m = V/E = C/6πr在SDS-電泳中，蛋白質(zhì)的泳動度與其大小成反比,測定蛋白質(zhì)分子量,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17,000～165,000之間時，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的電泳遷移率

56、與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：lgMW=lgK－bm MW為蛋白質(zhì)的分子量，m為相對遷移率，K為常數(shù)，b為斜率 將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS -聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。,,,5.聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳(Isoelectric Focusing-PAGE，IEF-PAGE),聚丙烯酰胺凝膠中加入一種

57、合成的兩性電解質(zhì)載體，在電場的作用下會自發(fā)形成一個連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)樣品在電泳中被分離，運動到等電點膠層時就失去所帶電荷而穩(wěn)定停留在該處，樣品中不同蛋白質(zhì)組分等電點不同，因而在等電聚焦電泳中得到有效分離。在等電聚焦電泳中，利用各蛋白質(zhì)組分等電點的差異，并不利用凝膠的分子篩作用。它的分辨力高，可分離等電點相差0.01~0.02pH單位的蛋白質(zhì)。,載體兩性電解質(zhì)商品有ampholine(LKB公司)、Pharmlyte(Pharmaci

58、a)、Serralyte(Serva)以及國產(chǎn)的Ampholine(上海生化所東風(fēng)廠生產(chǎn))。Ampholine是具有多等電點的多氨基多羧基酸類化合物。,,隨機(jī)加成,多胺同系物,丙烯酸,加成度不同的混合物，分子量大小不同，胺基和羧基的比例不同。,載體兩性電解質(zhì)及對應(yīng)的電極緩沖液,主要理化性質(zhì)為：①緩沖性能強(qiáng) Ampholine溶液在一定PH范圍內(nèi)有充分的緩沖能力，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入與其等電點相應(yīng)的PH區(qū)域時，PH值并無變化；②導(dǎo)電性能好

59、 Ampholine溶液有均衡的電場強(qiáng)度，但是在PH等于中性的區(qū)域?qū)щ娦阅茌^差。因此在應(yīng)用時，不管選擇什么PH范圍，一般都要加入其總量1/10的PH6～8的Ampholine溶液，以保持電場強(qiáng)度的均勻性；③分子量小 Ampholine一般分子量都在300～1000之間。一便用分子篩或透析等方法將它與被分離的高分子物質(zhì)分開；④紫外吸收值低 Ampholine對于在280nm處測定蛋白質(zhì)吸收值的干擾小，但是如果蛋白質(zhì)濃度低，Amph

60、oline用量又高，則往往干擾較明顯，嚴(yán)重時應(yīng)進(jìn)行矯正；⑤一般與樣品不起化學(xué)反應(yīng)。,pH梯度形成的機(jī)制,載體兩性電解質(zhì)既有酸性基團(tuán)(—NH2＋－)，也有堿性基團(tuán)(—COO－)，既可接受質(zhì)子，也可釋放質(zhì)子。在溶液中的兩性電解質(zhì)一方面受溶液pH值的影響，決定其帶電的性質(zhì)；另一方面，它又影響周圍環(huán)境（水溶液），使其pH值有所改變。在制備聚丙烯酰胺凝膠時，將其混溶其中。電泳時凝膠板正極的電極液是磷酸，負(fù)極是氫氧化鈉。 ◆◆正極

61、是酸性環(huán)境，載體兩性電解質(zhì)都帶正電荷，但由于pI的不同，其所帶正電荷數(shù)量就有所差異電泳時，向負(fù)極泳動的速度也就因此不同。 ◆◆ 負(fù)極是堿性環(huán)境，載體兩性電解質(zhì)帶有數(shù)量不等的負(fù)電荷，以不同速度向正極泳動。 ◆◆在泳動過程中又不斷地與溶液交換質(zhì)子，改變了溶液的pH。當(dāng)達(dá)到平衡時，不再出現(xiàn)質(zhì)子的交換時，載體兩性電解質(zhì)到達(dá)等電點并各處于自己的pI區(qū)域，不在移動。 ◆◆ 所以，溶液也因此呈現(xiàn)不同的pH，隨載體兩

62、性電解質(zhì)的pI梯度而形成pH梯度。,,(1)靠近陽極端的載體兩性電解質(zhì),電負(fù)性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫離子的能力,使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陰極順延;(2)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì),電正性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫氧根離子的能力,使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陽極順延。,,,pH 3,pH 10,,,pH 7,NaOH,H3PO4,6. 雙向電泳（two-dimensional electrophores

63、is）,如果將等電聚焦電泳與SDS-PAGE結(jié)合起來，就是分辨率更高的一種雙向電泳。雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直方向反映出它們在分子量上的差別。所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點不同的蛋白質(zhì)以及等電點相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開。單向SDS－PAGE電泳分辨力差，僅能分開50左右種的蛋白；IEF-PAGE分辨力稍高，也只能分開100多種蛋白質(zhì)；雙向電泳可分辨1000種以上的蛋白

64、質(zhì)，一般為2000～15000種。,,,,,,,（四）毛細(xì)管電泳,定義： 毛細(xì)管電泳是在散熱效率極高的、空芯的、微小內(nèi)徑（10-200μm）的毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行的大、小分子高效分離技術(shù)。,2. 毛細(xì)管電泳儀基本結(jié)構(gòu)圖,,毛細(xì)管：長：47cm, 57cm, 67cm;直徑：5-200 μm,,進(jìn)樣系統(tǒng)：氣壓進(jìn)樣、電壓進(jìn)樣。,冷卻系統(tǒng):液冷、風(fēng)冷。,高壓系統(tǒng):1-30kV。,毛細(xì)管電泳的檢測器：紫外檢測器、二極管陣列檢測器、激光誘發(fā)

65、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器、質(zhì)量（質(zhì)譜）檢測器等。,,PRINCE 700毛細(xì)管電泳儀,CEC-加壓毛細(xì)管電色譜,3. 毛細(xì)管電泳的分類,1、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）2、分子體積排除（篩濾）電泳或 凝膠電泳（CGE）3、等電聚焦電泳（IEF）4、膠束電動力學(xué)電泳（MECC）5、等速聚焦電泳（ITP）,4. 毛細(xì)管電泳的主要優(yōu)點,1、高靈敏度2、高分辨3、速度快4、進(jìn)樣少5、成本低,高靈敏度：紫外檢測器的檢測極限

66、在10-13—10-15mol之間，熒光檢測可達(dá)10-19—10-21mol,高分辨：峰分離效率超過1百萬理論塔板數(shù)，一般可達(dá)幾十萬。,速度快：許多分析在10分鐘內(nèi)完成。,進(jìn)樣少：一般需要毫微升的進(jìn)樣量。,成本低：一般只需要可長期使用的毛細(xì)管和極微量的可自己配制的緩沖液。,5.毛細(xì)管電泳的應(yīng)用領(lǐng)域,小型離子 小分子 肽類 蛋白質(zhì)

67、低聚核苷酸 DNA,毛細(xì)管電泳的應(yīng)用選擇,小型離子 小分子 肽類 蛋白質(zhì) 低聚核苷酸 DNA CZE MECC CZE CZE CGE CGE ITP CZE MECC CGE MECC ITP