新型T+1斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的構(gòu)建及其定向進(jìn)化.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是前體蛋白質(zhì)(precursorprotein)中的一段氨基酸序列。intein兩側(cè)的氨基酸序列被稱為蛋白質(zhì)外顯子(extein)。在前體蛋白質(zhì)的翻譯后成熟過程中intein從前體蛋白質(zhì)中自我切除，兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子以天然肽鍵的形式連接，這一成熟過程被稱為蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接(intein-mediatedproteinsplicing)。常見的intein按照其結(jié)構(gòu)特征被分為三類:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子(

2、canonicalintein)，微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子(mini-intein)和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(splitintein)。蛋白質(zhì)剪接的分子機(jī)制包括剪接位點(diǎn)的N-S(N-O)?；D(zhuǎn)化;分支中間物的形成;天冬酰胺殘基的環(huán)化和自發(fā)的S-N(O-N)的酰基重排四步反應(yīng)。C端外顯子(C-extein)的第一個(gè)氨基酸殘基較為保守，一般為CygSer/Thr，普遍認(rèn)為該氨基酸在intein自我剪接反應(yīng)中起重要作用。它所發(fā)動(dòng)的親核進(jìn)攻使N端內(nèi)含子與外顯

3、子間發(fā)生斷裂，由此推進(jìn)剪接反應(yīng)。因此，按C-extein首位氨基酸種類可將intein劃分為Cys+1(C+1)、Ser+1(S+1)和Thr+1(T+1)型三類。然而應(yīng)用于研究中的intein多為C+1和S+1型，它們僅在Cys和Ser前插入后行使功能，而在Thr前面插入時(shí)喪失原有剪接活性，這無疑限制了intein在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。獲得一類對C-extein首位氨基酸通用性高的splitintein，使其得到廣泛的應(yīng)用具有重

4、要意義。
　　 本課題的研究目的是獲得具有高剪接活性的T+1型蛋白質(zhì)內(nèi)含子，并且通過定向進(jìn)化提高其在異源宿主蛋白中剪接的通用性。本研究首先對四個(gè)均來自Trichodesmiumerythraeum的天然蛋白質(zhì)內(nèi)含子，即:TerDnaB-1、TerRIR1-4、TerSnf2和TerNds2進(jìn)行改造，分別獲得人工微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子，并利用麥芽糖結(jié)合蛋白（melrosebindingprotein,MBP）和硫氧還蛋白(thiored

5、oxin)組成的檢測系統(tǒng)對上述蛋白質(zhì)內(nèi)含子在大腸桿菌中的剪接活性進(jìn)行測試。結(jié)果表明在構(gòu)建的五個(gè)人工型微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子中，TerRIR-4、TerSnf2和TerNdse-2微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子在大腸桿菌中均可發(fā)生蛋白質(zhì)剪接，而TerDnaB-1以及其兩個(gè)不同的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子均沒有剪接能力。將剪接活性較高的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子TerSnf2進(jìn)一步改造成為不同的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子TerSnf2SO和TerSnf2S1，優(yōu)化剪接條件，分別測試其在體內(nèi)

6、、體外的剪接能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，SO和S1在體內(nèi)剪接效率均達(dá)到最高;結(jié)果也表明SO型蛋白質(zhì)內(nèi)含子在體外仍具有較高的剪接能力。
　　 為研究TerSnf2的1位和+1位保守氨基酸對其剪接的影響，以便對其剪接機(jī)制有更加深入了解，進(jìn)而為將其改造成為高效的蛋白質(zhì)內(nèi)含子工具提供有力依據(jù)，我們以TerSnf2微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子作為研究對象。研究結(jié)果表明:Snf-m1位上Cys是剪接必不可少的，而+1位上的

7、Thr則不是必需的，替換為Ser或Cys后Snf-m仍具有一定的剪接能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與斷裂水平結(jié)果完全吻合。說明該蛋白質(zhì)內(nèi)含子在不同氨基酸前插入時(shí)，具有一定插入位點(diǎn)的通用性。
　　 為了提高TerSnf2（T+1型）在異源蛋白質(zhì)中剪接的通用性，構(gòu)建了T+1型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的kanaR定向進(jìn)化篩選系統(tǒng)(directedevolution)，并應(yīng)用于TerSnf2微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的定向進(jìn)化。利用易錯(cuò)PCR法(error-pronePCR

8、)構(gòu)建相應(yīng)的突變庫，借助卡那霉素抗性所建立的蛋白質(zhì)剪接篩選系統(tǒng)進(jìn)行快速有效的突變體篩選以及利用抗組氨酸標(biāo)簽抗體(anti-Hisantibody)進(jìn)行Westem印跡對蛋白質(zhì)剪接活性進(jìn)行檢測。目前還沒有獲得陽性突變株，需要繼續(xù)篩選。
　　 通過隨機(jī)突變，加上功能選擇，以其達(dá)到定向進(jìn)化。通過這一研究策略，可獲得高剪接活性的進(jìn)化的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，為進(jìn)一步揭示蛋白質(zhì)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)與剪接功能之間的關(guān)系帶來新的啟示，為推測蛋白質(zhì)內(nèi)含子的起源和