用蛋白質(zhì)印跡聚合物研究蛋白質(zhì)間的相互作用及天然BiP氮端序列.pdf

1、本論文分為兩個(gè)部分:第一部分是帶有吡啶識(shí)別基團(tuán)的蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備及蛋白質(zhì)印跡聚合物作為抗體取代物對(duì)蛋白質(zhì)(BiP與FKBP23)之間相互作用的研究，第二部分是兩步法分離純化天然微量高分子量蛋白質(zhì)BiP及BiP氮端序列的研究。
　　研究蛋白質(zhì)相互作用的主要方法是免疫共沉淀法，需要先針對(duì)目標(biāo)蛋白制備出多克隆或單克隆抗體，過(guò)程相對(duì)復(fù)雜并且目的蛋白只有達(dá)到一定濃度才能與抗體結(jié)合形成沉淀，因而此方法只適用于研究高表達(dá)量的目標(biāo)蛋白，在應(yīng)

2、用上具有局限性。
　　第一部分工作中我們合成了一種含有隨機(jī)分布的吡啶識(shí)別基團(tuán)及雙鍵錨定基團(tuán)的輔助識(shí)別聚合物鏈(mARPCs)，并以其為輔助單體，以雙鍵修飾的聚乙烯醇大孔樹脂微球?yàn)檩d體，以克隆蛋白質(zhì)鼠BiP(mBiP)或豬FKBP23(pFKBP23)為模板分別制備了兩種蛋白質(zhì)印跡聚合物mPIPBiP及mPIPFKBP23。分別使用mPIPBiP和mPIPFKBP23對(duì)豬肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體提取物進(jìn)行吸附，通過(guò)銀染及western-blot在

3、洗脫液中同時(shí)檢測(cè)到BiP和FKBP23。證明了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體中BiP與FKBP23是特異性結(jié)合的。當(dāng)緩沖液中[Ca2+]調(diào)節(jié)到4mmol時(shí)，在洗脫液中只檢測(cè)到了BiP而沒(méi)有FKBP23或只檢測(cè)到了FKBP23而沒(méi)有BiP，說(shuō)明當(dāng)[Ca2+]為4mmol，BiP與FKBP23不結(jié)合，BiP與FKBP23之間的結(jié)合受[Ca2+]調(diào)控。這與使用生物抗體的免疫共沉淀方法得到的結(jié)果相一致。由此說(shuō)明蛋白質(zhì)印跡聚合物可以作為抗體取代物來(lái)研究蛋白質(zhì)間的相互

4、作用，為今后研究蛋白質(zhì)相互作用提供了一種新方法。
　　有研究表明，BiP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體中的Hsp70家族的成員，在進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體的分泌型蛋白質(zhì)和膜蛋白的折疊、貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮著重大的作用。本論文的第二部分工作是以豬BiP蛋白為研究對(duì)象，用以克隆的mBiP為模板制各的兩種蛋白質(zhì)印跡聚合物分別對(duì)豬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體提取物中的BiP進(jìn)行分離純化。通過(guò)對(duì)洗脫液進(jìn)行對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)印跡聚合物所吸附的非特異性蛋白質(zhì)有所不同，因此我們通過(guò)兩種蛋白質(zhì)印