蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化和溶液結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、基因表達(dá)調(diào)控因其重要性日益成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，其中，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控更是研究的熱點(diǎn)之一。mRNA降解就是通過控制翻譯次數(shù)在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控階段發(fā)揮重要作用。在大腸桿菌中mRNA降解包含兩個(gè)階段，第一個(gè)階段，mRNA的5'端從三磷酸根形式變?yōu)閱瘟姿岣问?。第二個(gè)階段，核酸內(nèi)切酶降解第一個(gè)階段生成的5'端為單磷酸根形式的mRNA。其中，第一個(gè)階段是限速步驟。以前的研究表明Nudix水解酶家族在不同的物種中具有mRNA降解第一個(gè)階段所需

2、要的單核苷酸焦磷酸水解酶活性。近來，有研究報(bào)道大腸桿菌Nudix水解酶家族的一員--RppH（以前稱為NudH），可以從RNA的5'端除去焦磷酸根。多序列比對顯示Nudix水解酶家族蛋白的N端非常保守，并且這一部分也是蛋白具有焦磷酸水解酶活性所必需的。然而直到目前，RppH生物活性的分子機(jī)制仍然未知。 目前，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)主要通過X-射線衍射，核磁共振(NMR)和電鏡(EM)等技術(shù)手段獲得。同x衍射和電鏡技術(shù)相比，核磁共振技

3、術(shù)具有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。第一，核磁共振技術(shù)可以在不破壞生物樣品并保持在溶液狀態(tài)下研究生物大分子蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能更真實(shí)反映蛋白質(zhì)在正常生理活性條件下的狀態(tài)。第二，蛋白質(zhì)分子在生物系統(tǒng)中存在不同時(shí)間尺度的運(yùn)動(dòng)，這種特性對于很多生物過程是非常重要的。核磁共振技術(shù)可以得到多個(gè)時(shí)間尺度內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)的信息，從而研究分子結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系。但核磁共振技術(shù)也存在成本較高，周期較長，對解析較大分子量的蛋白(>30KDa)時(shí)存在一些困難等缺點(diǎn)。

4、 本文運(yùn)用基因工程手段實(shí)現(xiàn)了RppH蛋白的克隆及其在大腸桿菌中的過量表達(dá)，表達(dá)條件是BL21(DE3)pLysS菌種，35℃，0.4mMIPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。然后通過陽離子柱和分子篩技術(shù)純化蛋白。在蛋白表達(dá)純化條件優(yōu)化成熟后，在M9培養(yǎng)基中大量表達(dá)蛋白，并且對蛋白進(jìn)行了13C和15N標(biāo)記。然后運(yùn)用核磁共振技術(shù)，解析了大腸桿菌RppH蛋白的高分辨率溶液結(jié)構(gòu)(BMRBID:16124，PDBID:2kdv)。結(jié)果顯示，RppH具有典型三

5、明治結(jié)構(gòu)，由5個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊組成，表面電荷圖顯示結(jié)構(gòu)上存在明顯溝槽，且溝槽背面為正電荷聚集區(qū)。同大腸桿菌Nudix家族其他蛋白相比，盡管氨基酸序列相似性不高，但三維結(jié)構(gòu)具有極高的相似性。在得到了RppH的結(jié)構(gòu)信息后，對其生物活性的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。以前的研究顯示，Nudix家族的蛋白表現(xiàn)活性需要Mg2+的參與，RppH的Mg2+滴定實(shí)驗(yàn)顯示滴定前后RppH的各殘基的化學(xué)位移并沒有變化。底物類似物ATP的滴定實(shí)驗(yàn)顯示滴定后Rp