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1、EDAG是一種與造血細(xì)胞分化調(diào)控密切相關(guān)的核蛋白質(zhì),對(duì)造血系統(tǒng)發(fā)育分化起重要調(diào)控作用,但對(duì)其作用機(jī)制尚缺乏深入的了解。因此,將EDAG蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入造血干細(xì)胞內(nèi),研究其對(duì)造血干細(xì)胞增殖、分化、凋亡調(diào)控的影響,將對(duì)闡明其作用機(jī)制及應(yīng)用前景具有重要意義。 為將EDAG蛋白質(zhì)有效導(dǎo)入造血干細(xì)胞,我們采用了基于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain,PTD)的蛋白質(zhì)跨膜遞送技術(shù)。它能將與之融合的蛋白質(zhì)以一
2、種濃度依賴的方式跨膜導(dǎo)入細(xì)胞,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高,每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度近乎相同,且對(duì)細(xì)胞損傷較小。目前,其在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用已受到廣泛的關(guān)注。 為優(yōu)化跨膜遞送技術(shù)各環(huán)節(jié)的條件,我們選擇綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)為研究對(duì)象,系統(tǒng)摸索了表達(dá)、純化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等條件。我們首先采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了PTD-GFP表達(dá)載體,共構(gòu)建VP22-GFP、Tat-GFP、Tat-GFP-Tat、Tat-GFP-9R4種融合蛋白質(zhì)原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染大腸桿菌
3、BL21,經(jīng)過(guò)摸索誘導(dǎo)劑濃度、菌密度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件,得到各融合蛋白質(zhì)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。在采用Ni-NTA親和純化柱純化融合蛋白質(zhì)時(shí),我們嘗試了兩種純化途徑:一是天然蛋白質(zhì)直接上柱純化(Native條件)、二是先對(duì)表達(dá)蛋白質(zhì)變性,然后純化并復(fù)性(Hybrid條件)。比較兩種純化路線所得蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力發(fā)現(xiàn),Hybrid途徑純化的融合蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力,其中Tat-GFP-Tat蛋白質(zhì)具有最強(qiáng)的活性。 隨后,我們分
4、別構(gòu)建了VP22-EDAG、Tat-EDAG、Tat-EDAG-Tat和Tat-EDAG-9R的原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21,經(jīng)誘導(dǎo)均可表達(dá)目的蛋白質(zhì),除由于VP22-EDAG表達(dá)量很低,未獲得純化蛋白質(zhì)外,其余得到相應(yīng)的蛋白質(zhì),并得到Western-bolt的驗(yàn)證。 本研究系統(tǒng)摸索了PTD融合蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等條件,并構(gòu)建了多種PTD-EDAG表達(dá)載體,經(jīng)初步純化獲得Tat-EDAG-Tat融合蛋白質(zhì),為進(jìn)一步研究
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