BDNF-PTD融合蛋白逆轉大腦缺血導致神經(jīng)死亡的藥效學和機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 血腦屏障主要由血管內(nèi)皮細胞和腦組織的星狀膠質細胞的足突構成,具有內(nèi)皮細胞之間緊密連接并且缺乏內(nèi)吞囊的特點,可限制血液和腦組織之間物質的自由交換,因此大多數(shù)藥物很難通過血腦屏障進入大腦發(fā)揮治療疾病作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)為生物體內(nèi)天然的蛋白分子,在神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育中,對神經(jīng)元的生存,分化起重要作用；具有增強學習記憶等功能,但同樣難以

2、通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療神經(jīng)退行性疾病。目前臨床上缺少一種有效的,非侵入性的方法使得BDNF通過血腦屏障而發(fā)揮生物學效應,因而限制了BDNF在臨床上的應用。所以,以何種給藥系統(tǒng)使BDNF進入大腦是發(fā)揮BDNF臨床治療作用應用的關鍵。目前在實驗室階段研究的腦靶向給藥系統(tǒng)主要包括:
　　 ①腦血管內(nèi)灌注或腦內(nèi)直接注射給藥。
　　 ②病毒載體介導基因后的腦內(nèi)直接注射給藥。
　　 ③脂質體包裹藥物后系統(tǒng)途徑給藥。

3、
　　 ④腦靶向單克隆抗體偶聯(lián)藥物后系統(tǒng)途徑給藥。
　　 但這些方法有很多的不足:
　　 ①腦血管內(nèi)灌注或腦內(nèi)注射給藥有極大的不順應性,且給藥后,藥物分布在很小的腦部位。
　　 ②病毒基因介導給藥雖然是很好的入腦載體,但并不適合臨床上的急性缺血的腦損傷的治療,因為腦損傷后在很短的時間內(nèi)給藥才能對神經(jīng)元細胞有保護和修復作用。而且病毒載體對人的免疫系統(tǒng),及細胞染色體組有副作用。
　　 ③用脂質體包裹藥

4、物能增加藥物的脂溶性,但腦對脂質體的攝入是絕對的和非特異性的,增加了藥物因全身分布而帶來的副作用和成本。
　　 ④單克隆抗體偶聯(lián)藥物進行靜脈給藥能夠使得BDNF通過血腦屏障到達大腦而發(fā)揮生物學效應,但這種方法得到的藥物,制備過程繁瑣,成本高:腦靶向用單克隆抗體需先進行人源化改造。
　　 如何尋找一種有效的,非侵入性的給藥系統(tǒng)方法,使得BDNF進入大腦發(fā)揮生物學效應?
　　 來源于人免疫缺陷病毒的TAT蛋白能夠跨膜

5、導入細胞內(nèi)部的發(fā)現(xiàn),給我們解決這個問題提供了很好的思路。蛋白轉導域(PTD)是指那些小于20個氨基酸、帶正電荷,可以穿過大多數(shù)細胞膜的穿膜肽的一個富含堿性氨基酸區(qū)域,帶正電荷的多肽片段與蛋白轉導功能相關聯(lián)。可以將大分子運輸入幾乎所有的哺乳動物細胞內(nèi),無需特殊的環(huán)境。其對給合物的大小沒有嚴格的限制,已經(jīng)在腫瘤,免疫治療等臨床前研究中取得了很大的進展。
　　 本實驗室前期通過基因工程方法制備了一種能通過血腦屏障的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子-

6、PTD融合蛋白(BDNF-PTD),實驗證明其能通過血腦屏障。在此基礎上,本文研究了BDNF-PTD在動物腦缺血模型中保護神經(jīng)元功能的藥效學及其作用機制。
　　 目的：
　　 研究本實驗中心制備的BDNF-PTD在動物腦缺血模型中保護神經(jīng)元功能的初步藥效學功能；通過神經(jīng)功能缺陷評分對非給藥組和給藥組進行神經(jīng)功能缺陷評價；研究本實驗中心制備的BDNF-PTD在動物腦缺血模型中保護神經(jīng)元功能的作用機制。
　　 方法<

7、br>　　 一、建立SD大鼠腦局部缺血模型
　　 大鼠用10％水合氯醛(3ml/100g)腹腔注射麻醉,仰臥固定在手術臺上,在頸部正中切開,剪開前筋膜,鈍性分離胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的間隙,暴露左側頸總動脈(CCA)和迷走神經(jīng),并分離。往遠心段找出頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA),干凈分離ECA、ICA。結扎ECA近分叉端和在距分叉處10mm結扎CCA,并在CCA近分叉處套線待用,用動脈夾夾住ICA。在距分叉處5mm

8、的CCA上用眼科剪45。剪一小斜口,插入栓線,通過分叉處進入ICA,提起在CCA近分叉處準備好的線,打好結但不能太緊,栓線能通過為合適,松開ICA處的動脈夾,繼續(xù)使栓線順I(yè)CA入顱方向推進,直到推進至分叉處17mm為止。將線栓和CCA固定,剪掉多余的栓線,縫合筋膜和皮膚。
　　 根據(jù)Bederson評分法進行神經(jīng)功能缺陷程度的評分。其原則如下:0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀,行為正常；1分:前肢屈曲；2分:中度神經(jīng)功能缺損,抵抗對側推

9、力下降伴前肢屈曲,無轉圈行為；3分:重度神經(jīng)功能缺損,抵抗對側推力下降伴前肢屈曲,有轉圈行為。1、2、3級為模型成功的標準。
　　 二、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠局灶性腦缺血治療作用的初步藥效學研究
　　 通過線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞(MACO)模型。永久性栓塞1個小時后腹腔給每只動物模型注射50ug(50ug/=ml)的BDNF-PTD,24小時后斷頭取腦,大腦切片TTC染色,比較栓塞1小

10、時后給藥模型組與未給藥模型組的腦梗死面積,觀察BDNF-PTD保護大腦缺血神經(jīng)元死亡的情況。
　　 三、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠局灶性腦缺血治療作用的機制研究
　　 BDNF能提高神經(jīng)元抵抗缺血的能力,具有促進受損神經(jīng)元的修復,再生,調節(jié)神經(jīng)結構的重建,促進腦損傷后認知功能恢復等作用。其作用的機制可能與兩個主要的信號途徑有關:磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)途徑和細胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激

11、酶(MAPK/ERK)途徑。它們通過激活轉錄蛋白(如cAMP效應元件結合蛋白)而影響基因的表達來促進神經(jīng)元的生長和存活。而促分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3-激酶途徑都與BDNF-TrkB受體信號調節(jié)有關。我們研制的BDNF-PTD具有逆轉神經(jīng)元死亡的功能,是否也是通過這些通路來發(fā)揮作用,這將在本課題研究中進行驗證。
　　 通過線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。永久性栓塞1個小時后腹腔給每只動物模型注射50ug(5

12、0ug/ml)的BDNF-PTD,24小時后斷頭取腦蛋白,通過免疫印跡法(WB),驗證BDNF-PTD是否可激活ERK1/2細胞外信號調節(jié)激酶和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)。
　　 結果
　　 一、成功建立SD大鼠腦局部缺血模型
　　 大鼠大腦缺血模型制作后,栓塞24小時后,發(fā)現(xiàn)給藥組和未給藥模型組、陰性對照組,在神經(jīng)功能活動上有不同的表現(xiàn)。根據(jù)Bederson評分法對每組模型進行神經(jīng)功能缺陷程度的評分,給藥組大

13、部分處于0到1分。而未給藥模型組及陰性對照組有抵抗對側推力下降伴前肢屈曲,和轉圈追尾運動,大部分處于2到3分。
　　 二、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)保護治療作用的初步研究
　　 大鼠大腦中動脈栓塞模型在栓塞1小時給藥,隨后24內(nèi)觀察大鼠偏癱癥狀,與未給藥模型組相比,給藥組大鼠偏癱癥狀得到明顯的改善。永久性栓塞24小時后,大腦冠狀切片TTC染色。梗死面積用Mean±SD表示,BDN

14、F-PTD給藥組與未給藥模型組、陰性對照組,比較結果有顯著性差別(F=26.791,P=0.000＜0.01)。發(fā)現(xiàn)1小時給藥模型組大鼠腦壞死區(qū)域面積與未給藥模型組相比明顯減少75％～80％。
　　 三、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠局灶性腦缺血治療作用的機制研究
　　 研究腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對大鼠局灶性腦缺血治療作用的機制。在本課題中,實驗結果證明,BDNF-PTD激活

15、ERK1/2,使其磷酸化,給藥模型組中pERK1/2蛋白表達水平較正常組均有顯著性升高(P<0.01)；與未給藥模型組中pERK1/2蛋白表達水平比較也均有顯著性升高(P<0.05)。
　　 另外,實驗結果也證明,BDNF-PTD能上調PI3K,給藥模型組中PI3K蛋白表達水平較正常組均有顯著性升高(P=0.000<0.01)；與未給藥模型組中PI3K蛋白表達水平比較也均有顯著性升高(P=0.000<0.01)；而未給藥模型組與

16、正常組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論
　　 一、在大鼠腦缺血模型中,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)能通過血腦屏障并且能發(fā)揮生物學效應。跟未給藥模型組對比,顯示BDNF-PTD能很好的保護腦缺血后的神經(jīng)元。
　　 二、在大鼠腦缺血模型中,證實了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)通過激活ERK細胞外信號調節(jié)激酶的磷酸化和上調磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),從而促進神經(jīng)元