長(zhǎng)效融合蛋白GGH的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其初步藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué).pdf

1、胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1)是由腸道L細(xì)胞合成和分泌的由30個(gè)氨基酸組成的多肽。體內(nèi)外研究顯示GLP-1具有增強(qiáng)葡萄糖依賴性的胰島素分泌、減少食物的攝取、減慢胃的排空、以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰p細(xì)胞增殖、促進(jìn)胰島再生、以及抑制胰β細(xì)胞的凋亡等功能，且無(wú)胰島素和磺脲類降糖藥物的低血糖危險(xiǎn)。GLP-1獨(dú)特的降血糖作用機(jī)制，是現(xiàn)有抗糖尿病藥物無(wú)可比擬的。但在體內(nèi)其極易被二肽酰基肽酶IV降解，限制了GLP-1藥物化的進(jìn)展，本論文主

2、要圍繞GLP-1的長(zhǎng)效性研究展開，主要結(jié)論如下：
　　 利用PCR的方法克隆獲得GLP-1及其突變體GLP-IA2G的基因，并構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(pGEX-4T-1-GLP-1)和BL21(pGEX-4T-1-GLP-1A2G)。SDS-PAGE顯示陽(yáng)性克隆在分子量29.0 kDa處有明顯的表達(dá)條帶，與預(yù)測(cè)的分子量大小相近。凝血酶酶切后，進(jìn)一步利用GST親和層析與分子篩G75純化獲得了目標(biāo)蛋白GLP-1和GLP-1A

3、2G。小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)證明，純化獲得的GLP-1和GLP-1A2G在小鼠體內(nèi)均有良好的控制血糖的生物活性，并且生物活性基本沒有差異。
　　 利用生物信息學(xué)軟件InsightII、ICM pro、Amber計(jì)算得出GLP-1的突變體GLP-1A2G與其突變體的串聯(lián)體(GLP-1A2G)2的合理構(gòu)象，并完成了其與GLP-1受體的分子對(duì)接，主要結(jié)合氨基酸殘基為V30、L32、V36、Y69和P90，大部分是脂肪族和芳雜環(huán)類氨基酸，提示四

4、個(gè)配體與nGLP-1R間的相互作用主要為疏水作用，并且計(jì)算得出GLP-1和突變體GLP-1A2G的與受體結(jié)合能相差不大，而(GLP-1A2G)2與受體結(jié)合能大于GLP-1和突變體GLP-1A2G，說(shuō)明(GLP-1A2G)2較GLP-1A2G更適合與白蛋白融合表達(dá)。
　　 利用重疊PCR技術(shù)，在體外成功拼接獲得了(GLP-1A2G)2和HSA的融合基因(GGH)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-GGH，并將其通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母

5、表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)G418抗性篩選得到高表達(dá)菌株KM71(pPIC9K-GGH)，在甲醇誘導(dǎo)下其表達(dá)量為162 mg/L，western-blot結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白為GLP-1突變體和HSA的雜合分子。
　　 對(duì)高表達(dá)菌株的發(fā)酵過程進(jìn)行了優(yōu)化，確定了畢赤酵母KM71(pPIC9K-GGH)的最佳生長(zhǎng)條件：溫度30℃、pH6.0、裝液量50-60 mL、甘油初始濃度4.0%、蛋白胨濃度2.0%。最佳表達(dá)條件：溫度30℃、pH6.

6、0、裝液量50-60 mL、誘導(dǎo)甲醇濃度2.0%。在最優(yōu)的條件下，畢赤酵母KM71(pPIC9K-GGH)菌體濃度最高達(dá)到21.0 g/L、最大比生長(zhǎng)速率達(dá)到1.70 g/L·h、目標(biāo)蛋白的最高產(chǎn)量達(dá)到245 mg/L、最大比產(chǎn)物生成速率達(dá)到3.38 mg/L，并且連續(xù)5個(gè)批次發(fā)酵水平穩(wěn)定，批次之間的相對(duì)誤差≤5%。
　　 確定了融合蛋白GGH的分離純化的主要步驟，即10000 r/min離心10 min，分子量10 kDa的b

7、iomax超濾膜濃縮20倍，大孔樹脂DA101脫色，Q FF離子交換，SephacrylS-200凝膠層析，整個(gè)純化過程的回收率為50.1%。經(jīng)SDS-PAGE和HPLC檢測(cè)純度大于95%，等電聚集測(cè)定等電點(diǎn)為4.6，符合下一步生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 融合蛋白GGH在體外對(duì)胰島原代細(xì)胞生長(zhǎng)有較好的刺激作用，在濃度45 nmoL/L時(shí)增殖率為35.4%，與單體的GLP-1相差不大。在糖耐量實(shí)驗(yàn)中，融合蛋白GGH可以

8、較好的控制小鼠的血糖水平，并且在給藥72 h后中、高劑量組仍然有控制血糖的生物活性，而單體的GLP-1在給藥4h后就檢測(cè)不到生物活性。
　　 藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，融合蛋白GGH在腹腔皮下單次給藥8h左右，血藥濃度達(dá)到最高，分布容積為53.4 mg/L·h，體內(nèi)吸收半衰期為26.6 h，體內(nèi)消除半衰期約為57.8h。大鼠皮下注射該藥后，主要臟器均于6h達(dá)峰，小鼠的胃、腎、肺和肌肉等組織器官中單位重量放射性積聚較高，其中以胃為最高；