GO-PTX和PGO-PTX的藥效學(xué)及藥代動力學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　紫杉醇是目前治療乳腺癌和卵巢癌的一線藥物，臨床療效較好。但是，紫杉醇的水溶性低是它的一大缺點，而臨床使用的紫杉醇助溶劑又有一些嚴(yán)重的副作用，如神經(jīng)毒性，腎毒性等。此課題中，氧化石墨烯紫杉醇（graphene oxide-paclitaxel，GO-PTX)和功能化的氧化石墨烯紫杉醇（functionalized graphene oxide-paclitaxel，PGO-PTX）是以氧化石墨烯和功能化的氧化石墨烯為載體

2、，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾及活性篩選后得到的新型紫杉醇載體藥物。前期研究表明，PGO-PTX和GO-PTX具有載藥量較高，水溶性較強(qiáng)，毒性較低的特點，在未來臨床應(yīng)用中具有廣闊的發(fā)展前景。
　　目的：
　　本課題旨在對GO-PTX和PGO-PTX，從細(xì)胞和動物水平，進(jìn)行抗腫瘤藥效學(xué)評價及大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究，為該新型載體藥物的更深入研究提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　PGO-PTX、GO-PTX對A2780細(xì)胞生長和凋亡誘導(dǎo)

3、的影響
　　本實驗采用經(jīng)典的MTT（四氮唑鹽）法，通過實驗數(shù)據(jù)計算細(xì)胞存活率及PGO-PTX、GO-PTX藥物的IC50，評價PGO-PTX、GO-PTX藥物對人卵巢癌細(xì)胞株A2780的增殖抑制作用，以及PGO、GO藥物載體對人卵巢癌細(xì)胞株A2780的毒性作用。同時，采用DAPI染色法檢測細(xì)胞凋亡效應(yīng)，通過對熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)的分析，評價PGO-PTX、GO-PTX的凋亡誘導(dǎo)作用，得出實驗結(jié)論。
　　PGO-PTX、GO

4、-PTX對荷瘤裸鼠移植癌的藥效學(xué)研究
　　本實驗建立了人卵巢癌細(xì)胞株A2780裸鼠移植瘤模型，進(jìn)行了PGO-PTX、GO-PTX藥物對荷瘤裸鼠移植癌的藥效學(xué)研究。20只雌性裸鼠隨機(jī)剪腳趾編號，均分為四組，即模型對照組，陽性對照組，PGO-PTX藥物組、GO-PTX藥物組。根據(jù)不同分組，在當(dāng)天及第3、5、7、9天尾靜脈注射相應(yīng)藥物或空白溶媒，并測量瘤塊大小。最后一天處死取瘤，稱重。對不同時間的腫瘤體積及瘤重抑瘤率進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，得

5、出實驗結(jié)論。
　　血漿中PGO-PTX、GO-PTX分析方法的建立
　　樣品處理采用甲基叔丁基醚沉淀蛋白的方法，選擇硝苯地平為內(nèi)標(biāo)，以乙腈-水（0.05％甲酸，PH=3.5）=45：55（v/v）為流動相等度洗脫，流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量10μL。以Thermo BDS HYPERSIL C18（2.1×100 mm I.D.，2.4μm）柱進(jìn)行分離；采用三重四級桿質(zhì)譜儀，以電噴霧電離源作為液相和質(zhì)譜連接的接口，多

6、反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行正離子檢測。用于定量檢測的離子對為m/z876.3→m/z308.0(紫杉醇)和m/z347.3→m/z315.4(內(nèi)標(biāo)硝苯地平)。通過對分析方法的確證，得出實驗結(jié)論。
　　PGO-PTX、GO-PTX在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究
　　本實驗進(jìn)行了PGO-PTX、GO-PTX在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，為藥物在動物體內(nèi)的變化規(guī)律提供重要的評價參數(shù)。將12只SD大鼠隨機(jī)分為三組，即紫杉醇組，PGO-

7、PTX組、GO-PTX組，每組4只，雌雄各半。實驗前一天 SD大鼠禁食過夜后，每組分別以0.14 mg/kg的藥物劑量，尾靜脈注射14μmol/L的紫杉醇、PGO-PTX和GO-PTX。分別于給藥前，及給藥后0，0.038，0.25，0.5，1，2，4，6，8小時，毛細(xì)管眼眶采血。檢測大鼠尾靜脈注射后的血藥濃度，并采用DAS2.0統(tǒng)計軟件計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)，繪制血藥濃度-時間曲線，得出實驗結(jié)論。
　　結(jié)果：
　　PGO-PT

8、X、GO-PTX對A2780細(xì)胞生長和凋亡誘導(dǎo)的影響
　　PGO-PTX、GO-PTX藥物對人卵巢癌細(xì)胞株A2780的增殖有抑制作用，其IC50分別為2.59μmol/L和2.44μmol/L。與陽性藥物紫杉醇注射液相比，PGO-PTX、GO-PTX藥物對人卵巢癌細(xì)胞株A2780的抑制作用無顯著性差異。藥物載體 PGO略有細(xì)胞毒性，GO沒有顯著的細(xì)胞毒性。同時，對給予不同濃度的PGO-PTX、GO-PTX藥物后的細(xì)胞進(jìn)行鏡下形態(tài)學(xué)

9、觀察，發(fā)現(xiàn)均有不同程度的細(xì)胞邊緣缺失，細(xì)胞核碎裂等變化。與陽性對照組相比，其凋亡誘導(dǎo)作用相當(dāng)。同時，隨著藥物濃度的遞增，凋亡誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢。
　　PGO-PTX、GO-PTX對荷瘤裸鼠移植癌的藥效學(xué)研究
　　實驗結(jié)果表明，與模型對照組相比，PGO-PTX藥物組、GO-PTX藥物組對小鼠卵巢癌移植瘤生長均有顯著的抑制作用，瘤體積有變小或不再生長的趨勢，瘤重抑瘤率分別為38.5%、40%。與陽性對照組相比，PGO-PTX

10、藥物組、GO-PTX藥物組與其腫瘤生長抑制作用相當(dāng)。本研究結(jié)果證明PGO-PTX、GO-PTX具有一定的抗癌效果。
　　血漿中PGO-PTX、GO-PTX分析方法的建立
　　本實驗所建立的測定大鼠血漿中PGO-PTX、GO-PTX的LC-MS/MS分析方法，樣品的測定不受血漿中雜質(zhì)的干擾，血漿中紫杉醇的線性范圍為0.25~1000 ng·mL-1，線性關(guān)系良好（R=0.9978），最低檢測濃度為0.25 ng·ml-1，提取

11、回收率高于75%，批內(nèi)和批間精密度RSD均小于10%，準(zhǔn)確度在0.53%～8.04%，待測藥基質(zhì)效應(yīng)在87.57%~101.68%之間，內(nèi)標(biāo)提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別為89.90%、97.34%。樣品的室溫，凍融、進(jìn)樣盤及長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，在本測定條件下，樣品較穩(wěn)定，未見明顯降解。該方法符合生物樣品分析要求，且專屬性強(qiáng)，靈敏度高，適用于大鼠血漿藥代動力學(xué)的研究。
　　PGO-PTX、GO-PTX在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

12、>　　大鼠血漿PGO-PTX、GO-PTX和紫杉醇的AUC0-t分別為4.36±0.92μg/L*h、21.48±5.81μg/L*h和24.17±4.92μg/L*h，T1/2為3.18±2.86 h、2.68±0.77 h和2.17±1.39h。實驗結(jié)果表明，PGO-PTX的AUC0-t遠(yuǎn)小于紫杉醇，而GO-PTX與紫杉醇的藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果相似。
　　結(jié)論：
　　在細(xì)胞、動物藥效學(xué)實驗中，PGO-PTX、GO-PTX皆