蜂斗菜總內(nèi)酯制備及抗腦缺血藥效學(xué)研究.pdf

1、毛裂蜂斗菜(Petasites tricholobus Franch.)是菊科蜂斗菜屬植物，廣泛分布于西南、西北地區(qū)，其根莖民間用于解毒祛瘀，外敷治跌打損傷、骨折蛇傷等，其花蕾在中國西北地區(qū)作為款冬花的替代品用于止咳、平喘。
　　 研究背景：蜂斗菜屬植物歐蜂斗菜(Petasites hybridus)作為植物藥，在歐洲已經(jīng)有幾百年的應(yīng)用歷史。其根莖的二氧化碳提取物用于治療偏頭疼，泌尿生殖道痙攣，哮喘，過敏性鼻炎等。倍半萜類化合物

2、被認(rèn)為是其主要有效成分，現(xiàn)代藥理研究表明，蜂斗菜素(petasin)和硫蜂斗菜素(S-petasin)等倍半萜類化合物具有抗炎，抗組胺，抗氧化，抑制白三烯合成，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用，從而達(dá)到抗炎、解痙的藥效。倍半萜內(nèi)酯類化合物，初步的體外藥理實(shí)驗(yàn)表明，這類化合物有具較強(qiáng)的抗氧化活性，抗炎作用，可減輕神經(jīng)毒性，具神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。為了開發(fā)我國蜂斗菜屬植物資源，本課題組在前期對(duì)其同屬植物毛裂蜂斗菜(Petasites tricholo

3、bus Franch.)的化學(xué)成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)性的研究，從毛裂蜂斗菜根莖中分離得到倍半萜內(nèi)酯類化合物蜂斗菜內(nèi)酯D、蜂斗菜內(nèi)酯B以及蜂斗菜內(nèi)酯Ⅰa，蜂斗菜內(nèi)酯Ⅱa，蜂斗菜內(nèi)酯Ⅲa，蜂斗菜內(nèi)酯Ⅳa，蜂斗菜內(nèi)酯Ⅴa5個(gè)倍半萜類新化合物。本論文作為延續(xù)性工作，著重對(duì)毛裂蜂斗菜內(nèi)酯類有效成分的制備工藝及抗腦缺血的藥效學(xué)進(jìn)行研究，旨在為毛裂蜂斗菜資源的開發(fā)利用以及毛裂蜂斗菜總內(nèi)酯的新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　 研究目的：通過對(duì)毛裂蜂斗菜中蜂斗

4、菜總內(nèi)酯(PTZNZ)的制備工藝及抗腦缺血的藥效學(xué)研究，明確其藥理活性，并對(duì)其藥效機(jī)理進(jìn)行深入的探討，為毛裂蜂斗菜的開發(fā)利用以及新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法和結(jié)果：
　　 1、采用HPLC方法，建立毛裂蜂斗菜根莖的內(nèi)酯類有效成分的含量測定方法并對(duì)并對(duì)毛裂蜂斗菜根莖的內(nèi)酯類有效部位進(jìn)行制備工藝研究，確定了最佳工藝路線。本工藝總內(nèi)酯在純化過程的平均轉(zhuǎn)移率為89.3％，產(chǎn)品平均純度為65.9％。
　　 2、蜂斗

5、菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ對(duì)缺氧-復(fù)氧致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究。采用缺氧-復(fù)氧致PC12細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型來篩選蜂斗菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、蜂斗菜總內(nèi)酯的生物活性。通過檢測蜂斗菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ預(yù)處理后對(duì)PC12細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷后的細(xì)胞存活率和乳酸脫氫酶的量來觀察其對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。采用MTT法檢測蜂斗菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ分別為15.6ng/ml、31.25ng/m

6、l、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml時(shí)對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示，這一系列濃度均能提高PC12細(xì)胞存活率，且效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性，故確定其最大劑量為2000ng/ml。缺氧預(yù)處理可以使PC12細(xì)胞存活率下降至(35.6±4.8)％；蜂斗菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ分別為最大濃度2000ng/ml時(shí)，可以使細(xì)胞存活率分別由(35.6±4.8)

7、％依次上升至(63.4±7.7)％、(68.1±1.4)％、(73.3±1.3)％、(75.3±0.7)％、(70.4±1.5)％。另外，檢測了蜂斗菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ濃度分別為20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml時(shí)對(duì)PC12缺氧-復(fù)氧損傷后釋放乳酸脫氫酶的影響。結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，缺氧處理后細(xì)胞上清液中LDH含量由391±14.5(U/L)升高到1319.8±48.6(U/L)(P＜0.01

8、)；蜂斗菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ為20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml時(shí)能降低細(xì)胞上清液中LDH含量，且效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。蜂斗菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ為最大濃度2000ng/ml時(shí)可以使細(xì)胞上清液中LDH含量分別由1319.8±48.6(U/L)降低至778±21.8(U/L)、674.7±23.3(U/L)、558.8±11.7(U/L)、520±15.2(U/L)、586.5±35.3(

9、U/L)(P＜0.01)。綜上所述，蜂斗菜內(nèi)酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ均能提高缺氧-復(fù)氧損傷后PC12細(xì)胞存活率，抑制其乳酸脫氫酶的釋放，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞。
　　 3、PTZNZ對(duì)線栓法致大鼠局灶性腦缺血的治療作用。建立線栓法致大鼠局灶性腦缺血的動(dòng)物模型來觀察蜂斗菜總內(nèi)酯對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。結(jié)果顯示：大鼠在手術(shù)后都有非常明顯的行為學(xué)缺陷和大腦組織壞死。PTZNZ5mg/kg對(duì)大鼠行為學(xué)評(píng)分及腦壞死百分率有降低作用，但僅腦壞

10、死百分率與模型組比較有顯著差(P＜0.05)；PTZNZ10mg/kg和20mg/kg對(duì)大鼠行為學(xué)評(píng)分和腦壞死百分率都有顯著的降低作用(P＜0.01，與模型組比較)。陽性藥銀杏葉片、依達(dá)拉奉也能有效改善大鼠的行為學(xué)缺陷、降低腦壞死百分率(P＜0.05，與模型組比較)。與陽性藥銀杏葉片、依達(dá)拉奉比較，PTZNZ各劑量(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)組對(duì)大鼠行為學(xué)及腦壞死百分率均無顯著性差異(P＞0.05)。故PTZNZ5m

11、g/kg、10mg/kg、20mg/kg對(duì)線栓法引起的大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有明顯的治療作用，能改善行為學(xué)缺陷，降低腦壞死百分率。
　　 4、PTZNZ對(duì)缺氧-復(fù)氧致大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。采用原代大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧-復(fù)氧模型，模擬缺血-再灌注對(duì)細(xì)胞造成的損傷，通過采用Hoechst-PI染色法、Tunel法和蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞存活率、凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白Bc1-2和Bax的表達(dá)來觀察蜂斗菜總內(nèi)酯對(duì)缺氧-復(fù)氧

12、致大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，缺氧處理后細(xì)胞存活率下降至50.4％(P＜0.05)，細(xì)胞調(diào)亡率上升至53.6％(P＜0.01)；蜂斗菜總內(nèi)酯最大劑量給藥組(2000ng/ml)與模型組比較，給藥組的細(xì)胞存活率上升至79.4％(P＜0.01)，細(xì)胞調(diào)亡率降低至30.3％(P＜0.05)。另外，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Bax、Bc1-2蛋白表達(dá)水平上升，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01

13、)；PTZNZ各個(gè)劑量給藥組(20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml)與模型組比較，給藥組的細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平下降，Bc1-2蛋白表達(dá)水平上升。給藥各個(gè)劑量組與模型組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且有一定的量效關(guān)系。表明蜂斗菜總內(nèi)酯各個(gè)劑量組(20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml)能不同程度地保護(hù)原代大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)，提高細(xì)胞增殖率，降低細(xì)胞凋亡率，并能下調(diào)促調(diào)亡蛋白Bax和上調(diào)抑調(diào)亡蛋白

14、Bc1-2，降低缺氧引起的細(xì)胞調(diào)亡率，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元作用。
　　 5、PTZNZ對(duì)缺氧-復(fù)氧致大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制探索。采用免疫熒光法和蛋白印跡法檢測NF-κB信號(hào)通路中P65、P-P65、P-IκB、IκB、IκK、P-IκK蛋白表達(dá)水平及NF-κB相關(guān)通路Akt和ERK中AKT、P-AKT、ERK、P-ERK的蛋白表達(dá)水平來觀察PTZNZ對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：缺氧處理后能上調(diào)NF-κB信號(hào)

15、通路中P65、P-P65、P-IκB、IκK、P-IκK蛋白的表達(dá)，下調(diào)IκB蛋白的表達(dá)，并能激活NF-κB通路的核轉(zhuǎn)錄；PTZNZ各劑量組(20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml)能下調(diào)P65、P-P65、P-IκB、IκK、P-IκK蛋白的表達(dá)，上調(diào)IκB蛋白的表達(dá)，并能抑制NF-κB通路的核轉(zhuǎn)錄。表明缺氧處理能激活NF-κB通路，PTZNZ(20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml)通過抑制NF-κB通路

16、的激活，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞作用，且有一定的量效關(guān)系。另外，模型組與正常組比較，NF-κB相關(guān)通路Akt和ERK中AKT、P-AKT、ERK、P-ERK的蛋白表達(dá)水平上升；PTZNZ各劑量組(20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml)能下調(diào)AKT、P-AKT、ERK、P-ERK蛋白的表達(dá)，且呈量效關(guān)系。表明缺氧處理能激活NF-κB通路及其相關(guān)通路Akt和ERK，PTZNZ通過抑制其激活，保護(hù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞。
　　 6、

17、PTZNZ初步急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTZNZ小鼠灌胃給藥的無毒劑量為4.0g/Kg(相當(dāng)與大鼠有效劑量的400倍)，半數(shù)致死量LD50值為6.9g/kg。
　　 結(jié)論：通過蜂斗菜總內(nèi)酯制備工藝得到的PTZNZ，其總內(nèi)酯含量為65.9％，平均轉(zhuǎn)移率為89.3％。本工藝適用于從提取液中純化PTZNZ，具有穩(wěn)定、快速、成品得率高及轉(zhuǎn)移率高的優(yōu)點(diǎn)。PTZNZ對(duì)線栓法引起的大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有明顯的治療作用，并對(duì)缺氧-復(fù)氧致神經(jīng)