轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白質(zhì)的純化及活性檢測.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Sox2是維持細(xì)胞自我更新與分化能力的主要調(diào)控因子,也是使體細(xì)胞發(fā)生重編程為多功能誘導(dǎo)干細(xì)胞(iPSCs)的關(guān)鍵因素。目前利用轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白質(zhì)Oct4和Sox2已經(jīng)成為一種取代DNA轉(zhuǎn)染,安全誘導(dǎo)iPSCs的最新途徑。但是由于重組蛋白質(zhì)溶解度和純度較低,降低了誘導(dǎo)效率和iPSCs的質(zhì)量,所以需要在重組蛋白質(zhì)表達(dá),純化方面提出改進(jìn)方法,以確保重組蛋白質(zhì)Oct4和Sox2能夠高效地進(jìn)入細(xì)胞并充分發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。

2、>　　通過對鼠源轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Sox2的密碼子進(jìn)行改良優(yōu)化,利用大腸桿菌BL21(DE3)和pET質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白質(zhì)。利用多步純化方法和蛋白質(zhì)陽離子試劑SPDP/PEI600分別提高轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白質(zhì)的純度和濃度。用熒光標(biāo)識重組蛋白質(zhì),并借助WesternBlot方法明確其在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動情況及穩(wěn)定程度。利用熒光素酶報告基因和靶基因Nanog的調(diào)控序列構(gòu)建載體,結(jié)合穩(wěn)定細(xì)胞株評估轉(zhuǎn)錄活性功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過以上方法可以