麥長(zhǎng)管蚜重要基因的篩選及其RNA干擾效果的研究.pdf

1、小麥蚜蟲屬同翅目蚜科，為刺吸式口器害蟲，是世界性小麥重要病蟲害之一，能造成小麥減產(chǎn)10％-30%。麥蚜吸食小麥汁液，嚴(yán)重時(shí)引起枝葉枯萎甚至整株死亡。此外，蚜蟲還是小麥黃矮病等病毒病的傳播體，能加重小麥病毒病危害。
　　小麥蚜蟲防治方法主要有施用殺蟲劑和種植抗蚜蟲小麥品種兩種途徑，其中后者是公認(rèn)的最為環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。目前，抗蚜蟲小麥新品種培育仍以雜交育種為主要手段，即利用來自小麥或其親緣種屬的抗蟲基因，通過小麥有性雜交培育抗

2、蚜蟲新品種。該方法的有效性受限于可利用的抗蚜蟲基因資源，抗蟲基因鑒定篩選與抗蚜蟲種質(zhì)創(chuàng)新對(duì)培育抗蚜蟲小麥新品種具有十分重要的意義。
　　近年來，以RNA干涉（RNAi）為核心的寄主誘導(dǎo)的基因沉默(host-induced gene silencing，HIGS)技術(shù)為培育植物抗病蟲害新品種開辟了新途徑。RNAi是由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。H

3、IGS技術(shù)是通過將含有病原物目的基因片段的反義發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體轉(zhuǎn)染到寄主植物中，在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生病原物基因特定序列的dsRNA，通過RNAi沉默侵染寄主植物病原菌內(nèi)源性基因的表達(dá)，從而達(dá)到防治病蟲害的目的。目前，HIGS技術(shù)在很多真菌病原物的基因功能研究和病害控制方面得到應(yīng)用，逐漸顯示出其巨大的應(yīng)用潛力。HIGS技術(shù)的成功與否很大程度上取決于RNA干涉靶基因（病原菌內(nèi)源性基因）的選擇。因此，小麥蚜蟲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖關(guān)鍵性內(nèi)源基因的篩選鑒定

4、是利用HIGS技術(shù)培育抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因小麥新品種的重要基礎(chǔ)。
　　本研究以為培育抗蚜蟲小麥新品種提供新抗源和新技術(shù)為出發(fā)點(diǎn)，開展了（1）小麥蚜蟲新抗源篩選鑒定和（2）小麥蚜蟲重要基因鑒定篩選與RNAi沉默效應(yīng)分析兩個(gè)方面的研究工作，取得如下結(jié)果：
　　1．小麥親緣種屬抗麥長(zhǎng)管蚜的篩選鑒定與抗蟲基因染色體定位。利用自制的抗蟲鑒定裝置，以78份中國(guó)春為遺傳背景的中國(guó)春-野生親緣種屬添加系為材料，以蚜情指數(shù)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了苗期麥長(zhǎng)管

5、蚜抗性篩選鑒定。結(jié)果篩選出1份高抗蚜蟲的長(zhǎng)穗偃麥草(Agropyron elongatum)的添加系，7份分別來自卵穗山羊草（Ae. geniculata）、尾狀山羊草（Aegilops caudata）、易變山羊草（Ae. peregrina）、黑麥（Secale cereale）的中抗蚜蟲添加系。在鑒定材料中，抗蚜蟲（包括高抗和中抗）添加系8個(gè)，占10.2%，感蚜蟲材料59份，占73.1%，高感蚜蟲材料11份，占16.7%。添加系遺

6、傳背景材料中國(guó)春表現(xiàn)感蚜蟲，通過中國(guó)春和中國(guó)春-野生親緣種屬添加系蚜蟲抗性鑒定結(jié)果對(duì)比分析，高抗蚜蟲的基因被定位在長(zhǎng)穗偃麥草的6E染色體上，其它7個(gè)中抗基因分別定位于長(zhǎng)穗偃麥草5E、卵穗山羊1Mg、尾狀山羊草D、易變山羊草1Sv和5Uv、黑麥7R以及擬斯卑爾脫山羊草6S染色體上。該研究為抗蚜蟲小麥新品種選育提供了珍貴的新抗源，并為后續(xù)抗性基因的精細(xì)定位、克隆及抗蚜蟲遺傳機(jī)制研究等提供了材料基礎(chǔ)。
　　2．構(gòu)建了篩選麥長(zhǎng)管蚜生長(zhǎng)發(fā)育

7、與繁殖過程重要基因的dsRNA飼喂篩選體系。以24孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板底部打孔加濾紙正放于水面上3cm處為作為培養(yǎng)麥長(zhǎng)管蚜的環(huán)境，紫外滅菌的雙層石蠟?zāi)A飼料，飼料配方引自陳巨蓮，培養(yǎng)溫度為25℃，光照周期16h：8h（L:D），并根據(jù)純飼料標(biāo)準(zhǔn)曲線為判斷基礎(chǔ)確定飼料對(duì)麥長(zhǎng)管蚜傷害影響最小的時(shí)間段（1-11天）作為飼喂篩選重要基因的時(shí)間區(qū)間。采用四齡蚜蟲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，接蟲于無菌培養(yǎng)板中饑餓5小時(shí)后加入飼料，每隔48小時(shí)更換新飼料，持續(xù)喂養(yǎng)7天更

8、換新培養(yǎng)板的飼喂體系。
　　3．從NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索收集蚜科（豆蚜、桃蚜、棉蚜、縊管蚜等）基因序列，設(shè)計(jì)56對(duì)特異引物，通過同源克隆成功從麥長(zhǎng)管蚜克隆到37個(gè)候選基因片段，并成功合成了29個(gè)候選基因的dsRNA。對(duì)其中19個(gè)候選基因片段進(jìn)行了DNA測(cè)序與序列比對(duì)分析，結(jié)果麥長(zhǎng)管蚜的候選基因片段與引物設(shè)計(jì)所用的蚜科昆蟲基因序列同源性均大于90%，均為蚜科昆蟲的保守序列。
　　4．利用dsRNA飼喂篩選體系，從29個(gè)麥長(zhǎng)管蚜的

9、候選基因篩選出2個(gè)RNAi沉默引起高致死率的麥長(zhǎng)管蚜重要基因（水通道蛋白及ATP合酶基因）。其中水通道蛋白基因dsRNA飼喂導(dǎo)致麥長(zhǎng)管蚜死亡率達(dá)到40.6%，ATP合酶基因dsRNA飼喂后蚜蟲死亡率達(dá)到26.5%。此外，葡萄糖脫氫酶基因dsRNA飼喂則促進(jìn)蚜蟲生長(zhǎng)發(fā)育，死亡率比對(duì)照純飼料飼喂下降19.5%。
　　5.挑選3個(gè)dsRNA飼喂死亡率顯著提高的基因（水通道蛋白、染色體驅(qū)動(dòng)蛋白、ATP合酶）和1個(gè)死亡率下降的候選基因（葡萄

10、糖脫氫酶編碼基因）進(jìn)行基因表達(dá)水平的熒光定量分析。結(jié)果水通道蛋白、染色體驅(qū)動(dòng)蛋白、ATP合酶水通道蛋白基因表達(dá)水平分別下降了74.8%，36.6%和44.6%；葡萄糖脫氫酶編碼基因表達(dá)水平上升了209.0%。
　　對(duì)比dsRNA沉默引起的蚜蟲死亡率和蚜蟲內(nèi)源基因表達(dá)水平熒光定量分析結(jié)果，dsRNA飼喂死亡率高的基因其基因表達(dá)水平也相應(yīng)降低，而死亡率降低的基因其基因表達(dá)水平則相應(yīng)提高，兩者趨勢(shì)一致。因此，利用dsRNA飼喂篩選體系，

11、根據(jù)dsRNA飼喂后麥長(zhǎng)管蚜的死亡率來作為基因RNAi效應(yīng)評(píng)價(jià)是準(zhǔn)確可行的，麥長(zhǎng)管蚜死亡率可以作為衡量其候選基因重要性的評(píng)價(jià)依據(jù)，可以為利用HIGS技術(shù)培育抗麥長(zhǎng)管蚜轉(zhuǎn)基因后代提供靶基因。
　　6.對(duì)5個(gè)基因（水通道蛋白、核糖體蛋白、ATP合酶、DNA損傷結(jié)合蛋白以及乙酰膽堿受體）設(shè)計(jì)多個(gè)不同區(qū)段的靶標(biāo)位點(diǎn)沉默，結(jié)果表明同一基因不同靶位點(diǎn)的沉默導(dǎo)致蚜蟲死亡率差異顯著。因而在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)對(duì)同一基因的多個(gè)靶序列進(jìn)行沉默，篩選出沉默效應(yīng)