利用RNA干擾技術(shù)研究豌豆蚜唾液腺基因的功能.pdf

1、豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)是一種重要的刺吸式害蟲，其分泌的唾液對(duì)取食寄主植物和傳播植物病毒有重要的作用。RNA干擾(RNAi)作為一種特異性抑制體內(nèi)基因表達(dá)的機(jī)制，其技術(shù)已成為研究昆蟲基因功能的主要方法之一。豌豆蚜相關(guān)基因組序列的公布，為蚜蟲的生物學(xué)和應(yīng)用研究提供了條件。為了探討蚜蟲唾液蛋白的功能，本研究建立了豌豆蚜的顯微注射技術(shù)體系，利用RNA干擾技術(shù)探索蚜蟲唾液腺基因的功能；另外，對(duì)豌豆蚜唾液腺的一個(gè)未知功能基因

2、家族做了深入研究?，F(xiàn)將主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果總結(jié)如下：
　　 1)豌豆蚜唾液腺基因信息分析
　　 根據(jù)文獻(xiàn)資料，通過NCBI，BCM，ExPASyProteomicsServer，Splign，ReverseComplement等5個(gè)網(wǎng)站分析豌豆蚜唾液腺中特異性表達(dá)的43個(gè)蛋白。其中8個(gè)蛋白功能已知，5個(gè)蛋白正在被研究；其中有12個(gè)是多拷貝基因，多拷貝之間的同源性在21％-99％之間不等；剩余的23個(gè)蛋白的基因是單拷貝，部分

3、基因ORF不完整。
　　 2)豌豆蚜RNAi
　　 向3齡豌豆蚜的若蚜體內(nèi)注射不同濃度(3、4.5、6μg/μL)GFP的dsRNA，觀察三種濃度下豌豆蚜的存活曲線沒有差異。為保證干擾的效果，選擇高濃度的dsRNA，即6μg/μL，注射體積為23nL。Contig3291，Contig3357，Contig3169，Contig3302這四個(gè)基因在注射dsRNA后的第1d存活率就比對(duì)照組顯著降低，而Contig10169

4、在注射dsRNA后第3d才與對(duì)照組的存活率有差異。
　　 采用比較Ct值的相對(duì)定量法(2-△△Ct法)計(jì)算了干擾后各基因的相對(duì)表達(dá)量：與對(duì)照組相比，Contig3357的dsRNA注射后1d和3d有顯著差異，干擾率分別為38.69％±10.33和34.44％±6.157；Contig3291的dsRNA注射后1d、2d、3d三天均有顯著差異，干擾率分別為49.8％±6.14、28.1％±4.93、45.1％±8.44；Conti

5、g3169的dsRNA注射后2d有顯著差異，干擾率為67.1±7.13％；Contig3302的dsRNA注射后3d有顯著差異，干擾率為34.9％±11.8；Contig10169的dsRNA注射后1d和3d有顯著差異，干擾率分別為55.28％±5.644和54.66％±9.806。這些數(shù)據(jù)說明在3齡若蚜體內(nèi)注射dsRNA能夠降低目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 3)豌豆蚜唾液腺未知功能蛋白家族的時(shí)空表達(dá)
　　 克隆了在豌豆蚜

6、唾液腺高表達(dá)的一個(gè)未知功能的蛋白家族，該家族包括13個(gè)基因，編碼14種蛋白，其中4個(gè)基因在唾液腺高表達(dá)。這個(gè)家族是蚜蟲特有的蛋白家族，富含半胱氨酸，14個(gè)半胱氨酸是保守的，其中的6個(gè)半胱氨酸形成三個(gè)CXXC結(jié)構(gòu)域。用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)了每個(gè)成員在豌豆蚜不同發(fā)育階段和不同組織間(腦、唾腺、消化道、卵巢)的表達(dá)，結(jié)果顯示這個(gè)家族沒有發(fā)育階段特異性，而有組織特異性。推測(cè)這個(gè)家族可能具有氧化還原酶或DNA甲基化酶的功能。
　　 本研

7、究建立起的RNAi體系，不僅可用來研究豌豆蚜基因的功能，而且也豐富了害蟲控制理論中該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，為害蟲控制研究了提供新的途徑和方法。克隆的未知功能蛋白家族包含了幾個(gè)在唾液腺中高表達(dá)的基因，這幾個(gè)蛋白序列含有信號(hào)肽，有可能是蚜蟲唾液重要的組成成分。作為一類危害農(nóng)作物的主要害蟲，刺吸式害蟲的防治一直是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，對(duì)其唾液成分的鑒定及功能研究，可為防治刺吸式害蟲提供新的思路和方法，如通過干擾唾液腺重要蛋白的表達(dá)來抑制蚜蟲的取食