利用RNA干擾技術(shù)沉默稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球有一半以上的人以稻米為主食，然而，蟲害卻是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一。稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis），俗稱卷葉蟲，刮青蟲、苞葉蟲等，屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是對(duì)水稻危害最為嚴(yán)重的主要害蟲之一。幾丁質(zhì)合成酶是昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)合成通路中最后一個(gè)酶，也是關(guān)鍵酶，在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用，是控制害蟲的理想靶標(biāo)。RNA干擾（RNA i

2、nterference, RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。本研究的主要目的是利用體外注射RNAi和轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)，獲得對(duì)稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶基因具有沉默作用的轉(zhuǎn)基因水稻植株，從而達(dá)到控制稻縱卷葉螟危害的目的，為其的生物防治奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　1.稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因的克隆及表達(dá)譜

3、r>　　采用RT-PCR結(jié)合RACE-PCR方法從稻縱卷葉螟中克隆得到幾丁質(zhì)合成酶A基因（CmCHSA）的全長(zhǎng)cDNA，其長(zhǎng)度為5223 bp，包含4695 bp的開放閱讀框，編碼1564個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示該酶有16個(gè)跨膜螺旋區(qū)，但無信號(hào)肽，等電點(diǎn)為6.63。同源建模預(yù)測(cè)顯示，CmCHSA的三維分子結(jié)構(gòu)中含5個(gè)α螺旋，4個(gè)β折疊片。氨基酸序列同源性分析表明CmCHSA的氨基酸序列與亞洲玉米螟Ostrinia furnacali

4、s幾丁質(zhì)合成酶A的氨基酸序列一致性最高，高達(dá)96％；與甜菜夜蛾Spodoptera exigua、甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae和棉鈴蟲Helicoverpa armigera等幾丁質(zhì)合成酶A的序列一致性也較高，分別為92%、92%和91%?；驎r(shí)空表達(dá)譜分析表明，CmCHSA在稻縱卷葉螟整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，在卵中的表達(dá)量最低，蛹中表達(dá)量最高；CmCHSA在檢測(cè)的成蟲各個(gè)組織中都有表達(dá)，其表達(dá)水平高低順序?yàn)椋罕砥ぃ绢^

5、部＞肌肉＞中腸＞卵巢＞馬氏管＞脂肪體＞精巢。
　　2.注射dsRNA干擾稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因的表達(dá)
　　以稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)兩個(gè)RNAi靶位點(diǎn)并將其命名為CmCHSA-I和CmCHSA-II，在體外合成CmCHSA的兩個(gè)dsRNA，用顯微注射法導(dǎo)入3齡幼蟲體內(nèi)，然后通過表型觀察和熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)干擾效應(yīng)。結(jié)果表明，注射兩種dsRNA后縱卷葉螟對(duì)水稻的取食明顯下降，生長(zhǎng)發(fā)育阻滯

6、，蟲體變小變黑和畸形，有的出現(xiàn)死亡。RT-qPCR表明，注射CmCHSA-I和CmCHSA-II兩種dsRNA在96 h后，CmCHSA的表達(dá)量相比對(duì)照分別下降了59%和64%。注射CmCHSA-I和 CmCHSA-II兩種dsRNA7 d后，稻縱卷葉螟的死亡率分別為80%和83.33%，與對(duì)照組相比，分別增加了66.67%和70%；且各組的校正死亡率為76.92%和80.77%。
　　3.重組RNA干擾植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定<

7、br>　　以CmCHSA-I和CmCHSA-II兩個(gè)片段為靶位點(diǎn)，分別在其兩端添加BamH I和Spe I酶切位點(diǎn)并進(jìn)行人工合成，經(jīng)雙酶切后與植物表達(dá)載體p1301連接，構(gòu)建p1301-CmCHSA-I*和p1301-CmCHSA-II*重組植物表達(dá)載體。PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果表明重組表達(dá)載體p1301-CmCHSA-I*和p1301-CmCHSA-II*已構(gòu)建成功，并采用液氮凍融法將其成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，構(gòu)建基因工程菌

8、。
　　4.轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及RNA干擾效應(yīng)檢測(cè)
　　用含有p1301-CmCHSA-I*和p1301-CmCHSA-II*質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404浸染中花11號(hào)粳稻愈傷組織，經(jīng)過愈傷組織的抗性篩選、分化和植株再生，獲得20株轉(zhuǎn)基因再生植株。靶標(biāo)位點(diǎn)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，6株是含有CmCHSA-I*的陽性轉(zhuǎn)基因植株，7株是含有CmCHSA-II*的陽性轉(zhuǎn)基因植株。用取食非轉(zhuǎn)基因水稻的稻縱卷葉螟作為對(duì)照，觀察發(fā)現(xiàn)取食每

9、株轉(zhuǎn)基因水稻后縱卷葉螟的生命活性明顯下降，生長(zhǎng)發(fā)育滯后，出現(xiàn)蛻皮受阻，蟲體變小、畸形和死亡等情況。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分株測(cè)定取食轉(zhuǎn)基因水稻稻縱卷葉螟體內(nèi)CmCHSA基因的mRNA表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)其死亡情況。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，取食轉(zhuǎn)入目的基因片段CmCHSA-I*水稻稻縱卷葉螟CmCHSA基因平均相對(duì)表達(dá)量相下降了56.8%；取食轉(zhuǎn)入目的基因片段CmCHSA-II*水稻稻縱卷葉螟CmCHSA基因平均相對(duì)表達(dá)量相下降了61%，死