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文檔簡介
1、芽孢桿菌屬中的一些成員能產生大量的生物活性分子,可以抑制病原菌的生長。枯草芽孢桿菌,作為普遍使用和充分研究的生物之一,其基因組中有4-5%用于合成抗菌物質,可以產生二十多種結構不同的抗菌化合物。其中,環(huán)狀脂肽surfactin具有強大的生物表面活性,同時具有抗細菌、抗腫瘤、抗病毒、抗支原體和防止纖維蛋白凝塊等生物活性。因此,研究人員對surfactin的興趣日趨增加,希望通過對surfactin等脂肽的改造獲得更具潛力的活性物質。
2、> Surfactin通過非核糖體多肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetases,NRPS)催化而得,合成酶中模塊的順序和類型決定了產物中氨基酸的順序。因此,通過對合成酶的修飾可以實現對產物的改造。在合成過程中,還涉及到一個功能酶Sfp(由sfp基因編碼),在Sfp缺失的情況下將不能產生surfactin。故對surfactin合成酶的改造分析,不僅包括對surfactin合成酶基因的改造分析,還包括s
3、fp基因的改造分析。
本論文主要對Bacillus subtilis fmbj中surfactin合成酶基因內編碼SrfAC-A結構域的基因進行克隆表達,并對其進行定點突變;將外源ssp基因整合入Bacillus subtilis168中,使其產surfactin。
主要結果分述如下:
1.從枯草芽孢桿菌fmbj中擴增出FsfAC-A基因,在大腸桿菌表達系統中表達,并對其活性進行了測定。
4、 根據NCBI上B.subtilis168菌株的srfAC-A基因序列,設計引物,用PCR的方法從枯草芽孢桿菌fmbj中克隆出sfAC-A基因,命名為FsrfAC-A。用酶切和酶連的方法將FsrfAC-A基因與表達質粒pET23a相連,并在大腸桿菌表達系統中進行表達。用Ni2+柱對重組蛋白FSrfAC-A進行分離純化后,用非放射性的方法測定其活性。測定結果發(fā)現,FSrfAC-A對Leu和Ile有選擇活性,且對Ile的活性更高。
5、r> 2.對FsrfAC-A基因進行了定點突變,將突變體在大腸桿菌表達系統中表達,并構建了突變基因重組整合質粒(用于枯草芽孢桿菌系統)。
用重疊延伸PCR的方法將克隆所得的FsrfAC-A基因進行突變,使FSrfAC-A結構域的278位由苯丙氨酸變?yōu)樘K氨酸,322位由半胱氨酸變?yōu)楸彼幔?31位由苯丙氨酸變?yōu)榘腚装彼?。將突變后基因分別連于pET23a和pET32a,并在大腸桿菌中表達,發(fā)現都為非可溶性表達。將突變后基
6、因與枯草芽孢桿菌整合質粒pE5916相連得到重組整合質粒,但因fmbj野生菌株的感受態(tài)制備不易,使后續(xù)實驗不能進行。
3.用同源重組的方法將外源sfp基因整合入枯草芽孢桿菌168菌株中,將其改造為產surfactin的菌株。
通過分析多株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和解淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的sfp基因,從基因的上下游找出較為保守的區(qū)域,設
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