α-法尼烯合成酶基因轉(zhuǎn)化豐產(chǎn)梨的研究.pdf

1、α-法尼烯是一種存在于生物體中的倍半萜類物質(zhì)，已知與植物的抗冷性、昆蟲的誘導及冷藏蘋果和梨果實重大生理病害－虎皮病的發(fā)生有關(guān)，是蘋果果實中重要的香氣成分之一。Α-法尼烯的生物合成是通過類異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑，α-法尼烯合成酶是調(diào)控α-法尼烯合成的關(guān)鍵酶，催化FPP轉(zhuǎn)變?yōu)棣?法尼烯。
　　 本實驗根據(jù)Genbank中注冊的α-法尼烯合成酶基因全長序列設(shè)計特定引物，利用熒光定量PCR和Western雜交的方法，鑒定初步獲得轉(zhuǎn)

2、基因植株，并研究了生理特性。主要結(jié)果如下：
　　 （1）構(gòu)建了pBI-AFS反義和RNAi表達載體，并轉(zhuǎn)化豐產(chǎn)梨，得到轉(zhuǎn)AFS基因的豐產(chǎn)梨植株。
　　 （2）以豐產(chǎn)梨組培苗為材料，優(yōu)化了豐產(chǎn)梨組培苗的生根及遺傳轉(zhuǎn)化體系，并成功將轉(zhuǎn)基因組培苗馴化移栽。最適宜豐產(chǎn)梨繼代的培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg/L +IBA0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+瓊脂6.0g/L，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA0.3mg/L+蔗糖30.0

3、g/L+瓊脂6.0g/L.
　　 （3）轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過RT-PCR和熒光定量PCR分析表明，野生型中α-法尼烯合成酶基因的相對表達量最高，反義轉(zhuǎn)化植株中有所降低，RNAi轉(zhuǎn)化植株中α-法尼烯合成酶基因的相對表達量最低。
　　 （4）通過克隆青香蕉蘋果的α-法尼烯合成酶基因（AFS）片段，構(gòu)建pEASY E1-AFS-原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，制備抗體，進行了Western雜交分析，顯示該基因在蛋白水平成功表達。