白樺纖維素合成酶基因BpCesA4的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、纖維素合成酶(cellulose synthase，簡(jiǎn)稱CesA)以UDP-葡萄糖為底物，催化葡萄糖聚合為葡聚糖苷鏈，在纖維素合成中具有非常重要的作用。CesA基因以多基因家族的形式存在。通過對(duì)白樺CesA基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，它們具有植物纖維素合成酶基因相應(yīng)的結(jié)構(gòu)特征:鋅指結(jié)構(gòu);8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其中兩個(gè)位于N端，6個(gè)位于C端;兩個(gè)易變區(qū)HVRⅠ和HVRⅡ;植物纖維素合成酶基因保守區(qū)P-CR;4個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)。為了研究白樺纖

2、維素合成酶基因在高等植物中發(fā)揮的作用，探討纖維素合成酶的保守性及表達(dá)情況，本研究以白樺的纖維素合成酶BpCesA基因的全長(zhǎng)序列為試驗(yàn)材料，并研究該基因在高等植物煙草中的表達(dá)情況。該研究主要針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室利用RACE技術(shù)克隆的全長(zhǎng)基因CesA4、對(duì)其進(jìn)行高效過量表達(dá)載體構(gòu)建、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因操作、PCR檢測(cè)和Sorthern雜交以及轉(zhuǎn)基因等試驗(yàn)工作，為深入研究白樺纖維素合成酶基因BpCesA4作用的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下：

3、
　　1.白樺纖維素合成酶基因BpCesA4過量表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:針對(duì)獲得的全長(zhǎng)白樺纖維素合成酶基因，選取載體pDONRTM221作為初步載體，載體pH7GWIWG2(Ⅱ)構(gòu)建過量表達(dá)載體。經(jīng)過PCR產(chǎn)物與過量表達(dá)載體的連接反應(yīng)以及反應(yīng)后目的基因克隆的篩選及鑒定等步驟，得到結(jié)果表明:獲得的克隆能擴(kuò)增出有效產(chǎn)物，條帶分布在3000bp，與預(yù)期的插入片段大小吻合，可以進(jìn)行序列測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)上網(wǎng)比對(duì)，與目的片段完全一致，證明

4、已經(jīng)獲得實(shí)驗(yàn)需要的過量表達(dá)載體，完成了白樺纖維素合成酶基因BpCesA4過量表達(dá)載體的構(gòu)建。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，采用電轉(zhuǎn)儀電擊的方式將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株中。轉(zhuǎn)化后進(jìn)行PCR檢測(cè)。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，所獲得的重組表達(dá)載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。可以進(jìn)行下一步農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因操作。
　　2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白樺纖維素合成酶基因BpCesA4轉(zhuǎn)化煙草:通過農(nóng)桿菌EH105介導(dǎo)，進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。建立并優(yōu)化了煙草的組織培養(yǎng)高頻再生體系

5、和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，討論了侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、抑菌操作抗生素的選擇、以及潮霉素篩選過程中抗生素濃度的篩選等問題，以及其對(duì)白樺外植體轉(zhuǎn)化率的影響，篩選出最佳的處理組合，并獲得了篩選后長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)基因煙草植株，為后續(xù)分子生物學(xué)檢測(cè)做好準(zhǔn)備
　　3.轉(zhuǎn)基因煙草的檢測(cè):采用PCR檢測(cè)以及Southern-blot對(duì)PCR確定的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明經(jīng)PCR檢測(cè)確定的陽性轉(zhuǎn)化植株中，均為陽性。陽性轉(zhuǎn)化植株的轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)為單拷貝整合，證明目的