α-法尼烯合成酶基因轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草的研究.pdf

1、植物萜類(lèi)是植物揮發(fā)物的主要組成成分，主要有由半萜、單萜、倍半萜、二萜、四萜等組成。它們?cè)谥参锵銡饨M成、昆蟲(chóng)誘導(dǎo)、植物防御、生長(zhǎng)調(diào)控等方面具有重要作用。Α-法尼烯是存在于多種植物的葉片、花和果實(shí)中的一種倍半萜類(lèi)揮發(fā)性有機(jī)化合物，已知與植物的抗冷性、昆蟲(chóng)的誘導(dǎo)及冷藏蘋(píng)果和梨果實(shí)重大的生理病害－虎皮病的發(fā)生有關(guān)。Α-法尼烯合成酶（AFS）是調(diào)控α-法尼烯合成的關(guān)鍵酶、最終酶，它催化FPP轉(zhuǎn)變?yōu)棣?法尼烯。近年來(lái)，通過(guò)外源萜類(lèi)合酶在植物體的表達(dá)

2、來(lái)研究萜類(lèi)合成以及異戊二烯途徑已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
　　 根據(jù)α-法尼烯合成酶基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特定引物，構(gòu)建正義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，研究α-法尼烯合酶的表達(dá)情況；利用多種蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)軟件和原生質(zhì)體定位研究α-法尼烯合酶在外源植物體中的定位，探討功能發(fā)揮位點(diǎn)和α-法尼烯合酶參與的途徑；檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草次生代謝物的含量變化，研究α-法尼烯合酶的表達(dá)對(duì)擬南芥、煙草異戊二烯途徑的影響。主要結(jié)果如下：
　　 （1）構(gòu)建

3、了pBI-AFS正義表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，得到轉(zhuǎn)AFS基因的擬南芥植株。
　　 （2）利用RT-PCR的方法和western雜交分析，檢測(cè)α-法尼烯合成酶在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平成功表達(dá)。
　　 （3）利用多種蛋白質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)分析和定位預(yù)測(cè)軟件（SignalP、TMHMM、TargetP、CLC ProteinWorkbench），對(duì)AFS蛋白進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析和信號(hào)肽定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)α-法尼烯合成酶不具有跨膜區(qū)域和信號(hào)肽，該酶

4、很可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 （4）通過(guò)克隆青香蕉蘋(píng)果的α-法尼烯合成酶基因（AFS）全長(zhǎng)，構(gòu)建pBI-AFS-GFP真核表達(dá)載體，制備擬南芥原生質(zhì)體，利用GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位確定α-法尼烯合酶在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
　　 （5）純化轉(zhuǎn)基因煙草品系，提取轉(zhuǎn)基因煙草T2代基因組，PCR篩選得到純合的T2代轉(zhuǎn)基因煙草。
　　 （6）GC/MS檢測(cè)揮發(fā)性萜類(lèi)、煙草甾體物質(zhì)的含量組成，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草中單萜、