褪黑素合成酶基因?qū)煵莺拓炄~連翹的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株抗氧化能力的增強(qiáng).pdf

1、褪黑素(melatonin，MT)是在脊椎動(dòng)物松果體(pinealbody)分泌的一種小分子的神經(jīng).內(nèi)分泌(neuroendocfine)激素。褪黑素作為一種動(dòng)物激素，可以調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物生物節(jié)律和光周期反應(yīng)，改善睡眠障礙，增強(qiáng)免疫等，并具有自由基清除劑和廣譜抗氧化劑的作用。目前，在植物方面的褪黑素研究主要局限于對一些植物內(nèi)源褪黑素含量的測定，對褪黑素在植物中的功能研究還剛剛開始，且報(bào)道很少，有關(guān)煙草(常用作轉(zhuǎn)基因操作的模式植物)和中藥植物

2、貫葉連翹(Hpericum peratum L.)的轉(zhuǎn)褪黑素合成關(guān)鍵酶基因報(bào)道尚未見到。 本研究通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，將美國Vanderbilt大學(xué)Xu Yao博士饋贈(zèng)的褪黑素生物合成酶……芳烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(.ArylalkylamineN-acetyltransferase，AANAT)與羥基吲哚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(HydroxyindoleO-methyltransferase，HIOMT)基因，分別導(dǎo)入煙草和貫葉

3、連翹中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并測定和分析了兩種轉(zhuǎn)基因植物中褪黑素含量變化，以及外源基因在兩種轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化方面的功能。所取得的主要研究結(jié)果如下：　　對含有AANAT-HIOMT?；虻闹参锉磉_(dá)載體YXu55進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒YXu55插入的AANAT基因序列與數(shù)據(jù)庫AANAT基因序列(序列號(hào)：L140347)同源性為100％，HIOMT基因序列與數(shù)據(jù)庫HIOMT基因序列(A型，序列號(hào)：U11090)的HIOMT基因型A-|5+7型

4、相吻合，同源性為100％；A ANAT與HIOMT基因表達(dá)盒以順式相連，并同方向與慶大霉素抗性基因表達(dá)盒串聯(lián)，常用相關(guān)酶切位點(diǎn)多是多位點(diǎn)。 以葉片切塊為外植體，通過不同激素配比的比較研究，建立了貫葉連翹的高效再生體系。在含有2,4.D1.0mg/L，NAA0.1mg/L的MS培養(yǎng)基上10～15d左右即形成愈傷組織且分化能力較強(qiáng)，在附加6-BA2.0mg/L，NAA0.2mg/L的MS培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出大量芽，分化率達(dá)100％，并

5、形成叢生苗。將小苗在附加NAA0.2mg/L的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d后即可誘導(dǎo)出根。在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中，分別探討了外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、pZPl22(僅含慶大霉素抗性標(biāo)記，不含AANAT-HIOMT基因的空白質(zhì)粒)和YXu55(含慶大霉素抗性標(biāo)記和AANAT-HIOMT'基因)兩種農(nóng)桿菌浸染濃度、時(shí)間對煙草和貫葉連翹兩種植物轉(zhuǎn)化頻率的影響。兩種植物外植體分別預(yù)培養(yǎng)2～3d，在OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌液感染25min，而后分別在

6、60mg/L和50mg/L的慶大霉素作選擇壓力下，獲得了兩種植物的陽性轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)PCR、Southern印跡分析、RT-PCR分析，證實(shí)褪黑素合成過程中關(guān)鍵酶基因AANAT-HIOMT已經(jīng)整合到煙草和貫葉連翹兩種植物基因組，并能夠在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。 建立了檢測植物褪黑素含量的反相高效液相色譜紫外檢測(RP-HPLC)方法。色譜柱為SymmetryCt8(150mmx4.6mm，5.0gm)；流動(dòng)相為100mmol/L乙酸銨：

7、甲醇體積比80：20，檢測波長為265.8nm；靈敏度為2.00A[5FS；流速為0.8mL.min-1時(shí)，褪黑素濃度在20～500ng-m. (R2=0.9992)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為98.09％(n=6)，RSD=2.21％，最小檢出量為1.0ng.mL-1。褪黑素峰保留時(shí)間約為8min?！　⊥ㄟ^RP-HPLC測定了煙草和貫葉連翹兩種植物不同株系的轉(zhuǎn)基因及其親本(未轉(zhuǎn)基因植株)的褪黑素含量，發(fā)現(xiàn)YXu55(含慶大霉

8、素抗性標(biāo)記和AANAT-HIOMT基因)轉(zhuǎn)基因株系的褪黑素含量均高于pZPl22(僅含慶大霉素抗性標(biāo)記，不含AANAT-HIOMT基因的空白質(zhì)粒)轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)基因的對照植株；而pZPl22轉(zhuǎn)基因株系褪黑素含量跟未轉(zhuǎn)基因的對照植株的含量幾乎相等。 用褪黑素含量明顯提高的不同轉(zhuǎn)基因植物株系，分析了植物抗氧化系統(tǒng)的變化，初步得知褪黑素合成過程中的關(guān)鍵酶AANAT-HIOMT基因的導(dǎo)入使植物提高了抗氧化能力。與空白質(zhì)粒pZPl22轉(zhuǎn)