用RNA干擾技術(shù)研究人抗砷相關(guān)基因的功能.pdf

1、目的：砷在自然界分布廣泛，毒性較強(qiáng)，對生物體的影響也是多方面的，在生物進(jìn)化的過程中，許多生物從細(xì)菌到哺乳動物都產(chǎn)生了對抗砷毒的生理機(jī)制。我們在前期研究中已從人抗砷細(xì)胞株中篩選出了5條可能參與抗砷作用的基因。本研究選取人抗砷細(xì)胞株中表達(dá)明顯上調(diào)的3條ATP結(jié)合盒基因作為研究對象，利用RNA干擾技術(shù)，體外觀察抗砷基因的沉默作用，然后通過細(xì)胞毒性實驗分析目的基因阻斷前后，抗砷細(xì)胞株抗砷性的改變，力求找到明確的抗砷基因。 方法：化學(xué)合成

2、siRNA，在siPORT<'TM>NeoFX<'TM>轉(zhuǎn)染劑的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304細(xì)胞，用半定量RT-PCR，real time PCR和Western-blot方法檢測目的基因mRNA和蛋白水平的改變，然后通過MTT實驗分析小分子干擾RNA阻斷目的基因后，抗砷細(xì)胞株抗砷性的改變． 結(jié)果： (1)ABCAl體外合成的3條siRNA通過siPORT<'TM>NeoFX<'TM>轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV

3、-304細(xì)胞后，均能不同程度地抑制目的基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48h的real time PCR檢測顯示siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3組的目的基因的表達(dá)抑制率分別為32.08％±0.746％、55.08％±0.075％、87.09％±0.031％，與陰性對照組比較均有顯著性差異(p<0.05)。其中，siRNA-3的抑制作用最強(qiáng)。而陰性對照siRNA組與未轉(zhuǎn)染抗砷細(xì)胞組比較，ABCA1 mRNA表達(dá)無明顯減低(p>0.05)．

4、Western-blot方法檢測蛋白改變結(jié)果與PCR檢測相互一致。噻唑蘭法(MTT)進(jìn)行48h NaAsO2毒性試驗后，實驗組細(xì)胞對急性砷染毒表現(xiàn)出耐受性降低，siRNA-3組在各濃度下生存率都明顯低于同步對照組。實驗組LC50為8.05 μM，對照組LC50為11.09 μM。 (2)ABCE1體外合成的2條siRNA通過siPORT<'TM>NeoFX<'TM>轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304細(xì)胞后，均能不同程度地抑

5、制目的基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48h的real time PCR檢測顯示siRNA-1，siRNA-2的目的基因的表達(dá)抑制率分別為46.6％±0.339％、73.8％±0.545％，與陰性對照組比較均有顯著性差異(p<0.05)。其中，siRNA-2的抑制作用較強(qiáng)。而陰性對照siRNA組與未轉(zhuǎn)染抗砷細(xì)胞組比較，ABCE1mRNA表達(dá)無明顯減低(p>0.05).Western-blot方法檢測蛋白改變結(jié)果與PCR檢測相互一致。噻唑蘭法(MTT)

6、進(jìn)行48h NaAsO2毒性試驗后，實驗組細(xì)胞對急性砷染毒仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。 (3)ABCF1體外合成的3條siRNA通過siPORT<'TM>NeoFX<'TM>轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304細(xì)胞后，均能不同程度地抑制目的基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48h的real time PCR檢測顯示siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3組的目的基因的表達(dá)抑制率分別為76.73％±0.768％、65.39％±0.699％、5

7、2.16％±0.014％，與陰性對照組比較均有顯著性差異(p<0.05)。其中，siRNA-1的抑制作用最強(qiáng)。而陰性對照siRNA組與未轉(zhuǎn)染抗砷細(xì)胞組比較，ABCF1 mRNA表達(dá)無明顯減低(p>0.05)．Western-blot方法檢測蛋白改變結(jié)果與PCR檢測相互一致。噻唑蘭法(MTT)進(jìn)行48h NaAsO2毒性試驗后，實驗組細(xì)胞對急性砷染毒仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。 結(jié)論：siRNA可特異性的抑制目的基因的表達(dá)，ABCA1基