應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)旋毛蟲Nudix水解酶基因功能的研究.pdf

1、Nudix水解酶（Nudix hydrolase, Nd）是一種廣泛存在于多種生物體內(nèi)的一種水解酶。它可以水解多種有機(jī)焦磷酸鹽，包括核苷二磷酸鹽、核苷三磷酸鹽、二核苷酸多磷酸鹽、二磷酸肌醇多磷酸鹽、核苷酸糖和RNA帽端。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲Nudix水解酶（Trichinella spiralisNd, TsNd）與旋毛蟲侵入小鼠小腸上皮細(xì)胞（IEC）有關(guān)。
　　本研究通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)研究旋毛蟲肌幼蟲的TsN

2、d基因功能，觀察TsNd基因被沉默后旋毛蟲幼蟲在體外的存活情況、感染能力和雌蟲生殖力。首先設(shè)計(jì)與TsNd同源的dsRNA和siRNA，通過(guò)浸泡法和電穿孔法將其導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)。然后通過(guò)Real-time PCR技術(shù)和Western blotting技術(shù)分別幼蟲TsNd基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dsRNA和siRNA均能導(dǎo)致TsNd表達(dá)明顯降低。同時(shí)設(shè)計(jì)一條與旋毛蟲蛋白酶體β7亞基（Tspst）同源的dsRNA，用

3、來(lái)驗(yàn)證RNAi具有基因特異性，即dsRNA-TsNd和dsRNA-Tspst只能分別引起與它們同源的基因沉默。將dsRNA-TsNd和siRNA導(dǎo)入旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)后，在培養(yǎng)過(guò)程中觀察幼蟲存活情況。體外觀察TsNd基因沉默對(duì)旋毛蟲幼蟲侵入IEC的影響，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察TsNd基因沉默對(duì)旋毛蟲幼蟲在體內(nèi)侵入腸粘膜及其發(fā)育和生殖力的影響。
　　材料與方法:
　　1.材料
　　本實(shí)驗(yàn)所用旋毛蟲（T. spiralis,T1）由昆

4、明小鼠保種和傳代。pGEM-T-TsNd/M109：含旋毛蟲 TsNd基因重組質(zhì)粒菌株，由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建和保存。pMAL-C2X-Tspst/BL21：含旋毛蟲Tspst基因重組質(zhì)粒菌株，由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建和保存。實(shí)驗(yàn)用BALB/c小鼠：購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
　　2. dsRNA和siRNA的設(shè)計(jì)與合成
　　登陸GenBank查詢TsNd和Tspst的mRNA序列。① dsRNA的設(shè)計(jì)與合成；選取TsNd mRNA650~

5、1301bp和Tspst mRNA88~742bp作為2條dsRNA的靶序列。根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)含有T7啟動(dòng)子的PCR引物，以含TsNd和Tspst的重組質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增得到含T7啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物，即dsRNA體外轉(zhuǎn)錄模板，然后體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA-TsNd和dsRNA-Tspst。②siRNA的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)TsNd mRNA序列，設(shè)計(jì)3個(gè)siRNA和1個(gè)對(duì)照 siRNA，根據(jù)siRNA靶向mRNA的位點(diǎn)，分別命名為siRNA-

6、275、siRNA-425、siRNA-715和對(duì)照siRNA，用FAM熒光標(biāo)記對(duì)照siRNA，以便在轉(zhuǎn)染過(guò)程中跟蹤siRNA。
　　3.將dsRNA和siRNA導(dǎo)入旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)
　　應(yīng)用浸泡法和電穿孔法，分別將20、40或60 ng/μLdsRNA，1、2或3μM siRNA和Control siRNA分別導(dǎo)入旋毛蟲幼蟲體內(nèi)，其中對(duì)照siRNA組旋毛蟲幼蟲可以在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，以確定 siRNA是否被成功導(dǎo)入

7、到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)。
　　4. RNAi對(duì)TsNd基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平的影響
　　利用Real-time PCR和Western blotting分別檢測(cè)dsRNA和siRNA處理后幼蟲TsNd基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。
　　5. RNAi對(duì)TsNd基因干擾的特異性分析
　　用浸泡法分別將40ng/μL dsRNA-TsNd和dsRNA-Tspst導(dǎo)入旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)，檢測(cè)2組旋毛蟲肌幼蟲中TsNd和Tsps

8、t表達(dá)水平的變化。
　　6. TsNd基因沉默后對(duì)幼蟲體外存活及侵入IECs的影響
　　利用浸泡法和電穿孔法，將dsRNA、siRNA和對(duì)照 siRNA分別導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)后，觀察幼蟲體外死亡率。將100條經(jīng)過(guò)1、1.5、2、2.5、3μM siRNA-275或20、30、40、50、60ng/μl dsRNA-TsNd電穿孔處理后18h的肌幼蟲與500μl半固體培養(yǎng)基混勻后接種到24孔板中的IECs單層上。37℃、5

9、％ CO2孵育2h后觀察幼蟲侵入率。
　　7. TsNd基因沉默對(duì)旋毛蟲侵入腸粘膜及其發(fā)育和生殖力的影響
　　將160只 BALB/c小鼠分為8組（每組20只）：dsRNA浸泡法3組（dsRNA-TsNd處理組、轉(zhuǎn)染試劑Lip2000和PBS對(duì)照組）、dsRNA電穿孔法2組（dsRNA處理組和PBS對(duì)照組及siRNA電穿孔法3組（siRNA-275處理組、對(duì)照siRNA處理組和PBS對(duì)照組）。將TsNd基因沉默后的幼蟲經(jīng)口感

10、染小鼠（300條幼蟲/只）。感染后6d后剖殺10只小鼠收集成蟲，感染后35d后剖殺另外10只小鼠收集肌幼蟲，計(jì)算腸道成蟲荷和肌幼蟲荷及其減蟲率。將收集的成蟲進(jìn)行體外培養(yǎng)72h，收集新生幼蟲，計(jì)算雌蟲體外72h新生幼蟲產(chǎn)量，作為成蟲生殖力指標(biāo)。雌蟲體外72h新生幼蟲產(chǎn)量=72h新生幼蟲數(shù)/雌蟲數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1. dsRNA和siRNA的導(dǎo)入：瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2個(gè)清晰條帶：dsRNA-TsNd（691bp）和ds

11、RNA-Tspst（694bp），結(jié)果與預(yù)期大小相同。
　　2.熒光標(biāo)記跟蹤結(jié)果顯示,通過(guò)電穿孔法將對(duì)照siRNA導(dǎo)入到幼蟲18h后，在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)幼蟲體內(nèi)有明顯的熒光，而未處理的幼蟲則無(wú)熒光。
　　3. dsRNA對(duì)旋毛蟲肌幼蟲TsNd轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的影響
　　（1）用浸泡法將20、40和60 ng/μl dsRNA-TsNd導(dǎo)入幼蟲后1d，Real-time PCR結(jié)果顯示，20、40和60 ng/μl dsR

12、NA-TsNd處理組TsNd mRNA表達(dá)量相對(duì)于PBS對(duì)照組分別為48.7%、34.7%和29.5%，表達(dá)量的降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；lip2000對(duì)照組與PBS對(duì)照組之間TsNd mRNA表達(dá)量沒有明顯變化（P＞0.05）。
　?。?）用浸泡法將40ng/μl dsRNA-TsNd導(dǎo)入幼蟲后1d、2d、3d、4d、5d和6d時(shí)，Real-time PCR結(jié)果顯示，dsRNA處理組TsNd mRNA表達(dá)量相對(duì)于PBS

13、對(duì)照組分別為34.2%、42.7%、52.3%、57.7%、79.7%和86.2%（F1d=7.429，F(xiàn)2d=0.013, F3d=0.016，F(xiàn)4d=10.002，F(xiàn)5d=5.173，F(xiàn)6d=0.715；P＜0.05）；lip2000對(duì)照組與PBS對(duì)照組之間TsNd mRNA表達(dá)量沒有明顯變化（P＞0.05）。Western blotting結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS對(duì)照組，dsRNA-TsNd處理組在浸泡處理后第1d、2d、3d、4d

14、、5d、6d時(shí)，TsNd表達(dá)量分別為101.2%、78.7%、43.6%、44.3%、89.2%、100.6%。而lip2000對(duì)照組相對(duì)于PBS對(duì)照組TsNd表達(dá)量沒有明顯變化。電穿孔處理后3d，dsRNA-TsNd處理組TsNd表達(dá)量相對(duì)于PBS對(duì)照組為41.8%。
　?。?）電穿孔法將40ng/μl dsRNA導(dǎo)入幼蟲后1d，與PBS對(duì)照組相比，TsNd mRNA表達(dá)量降低了74.2%（F=7.033，P＜0.05）。

15、>　　4. siRNA對(duì)旋毛蟲肌幼蟲TsNd轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的影響
　?。?）通過(guò)電穿孔法將2μM siRNA-275、siRNA-425或siRNA-715導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)后1d，siRNA-275、siRNA-425和siRNA-715處理組幼蟲TsNd基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于PBS對(duì)照組分別為26.7%、77.4%和83.7%(P＜0.05)。Control siRNA處理組幼蟲TsNd基因轉(zhuǎn)錄水平與PBS對(duì)照組相比沒有明顯差

16、異（P＞0.05）（4.7 A）。Western blotting結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，siRNA-275、siRNA-425和siRNA715處理組TsNd表達(dá)量分別為23.3%、79.5%和94.8%。對(duì)照siRNA處理組TsNd表達(dá)量相對(duì)于PBS對(duì)照組無(wú)明顯變化（P＞0.05）。
　?。?）通過(guò)電穿孔法將1μM、2μM或3μM siRNA-275導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)后1d，1μM、2μM和3μM siRNA-275

17、處理組幼蟲TsNd基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于PBS對(duì)照組分別為48.0%、27.7%和19.2%(P＜0.05)。Control siRNA處理組幼蟲TsNd基因轉(zhuǎn)錄水平與PBS對(duì)照組相比沒有明顯差異（P＞0.05）（4.7 B）。
　　（3）通過(guò)電穿孔法將2μM siRNA-275導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)后1d、3d、5d和7d，幼蟲TsNd基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于PBS對(duì)照組分別為27.7%、39.3%、49.7%和57.9%(P＜0.05)

18、。Control siRNA處理組幼蟲TsNd基因轉(zhuǎn)錄水平與PBS
　　5. RNAi對(duì)TsNd基因干擾的特異性分析
　　用浸泡法分別將 dsRNA-TsNd和 dsRNA-Tspst導(dǎo)入幼蟲體內(nèi)后，Real-time PCR結(jié)果顯示，dsRNA-TsNd處理組與PBS對(duì)照組相比，TsNd mRNA表達(dá)量降低了74.6%（P<0.05），而Tspst mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。dsRNA-Tspst處理組與P

19、BS對(duì)照組相比，TsNd mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），而Tspst mRNA表達(dá)量降低了73.2%（P<0.05）。Western blotting分析顯示，與PBS空白對(duì)照組相比，dsRNA-TsNd處理組TsNd表達(dá)量降低了62.9%（P＜0.05），Tspst表達(dá)量則沒有明顯變化（P＞0.05）；而dsRNA-Tspst處理組TsNd表達(dá)量沒有明顯變化（P＞0.05），而Tspst表達(dá)量則降低了60.6%（P＜0.05

20、）。結(jié)果表明，RNAi對(duì)TsNd基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的干擾均具有特異性。
　　6. dsRNA和siRNA對(duì)旋毛蟲體外存活的影響
　　dsRNA浸泡法處理組、Lip2000和PBS對(duì)照組的幼蟲死亡率分別為32.2%、34.2%和33.6%（χ2=0.138，P＞0.05）。dsRNA電穿孔處理組和PBS組的幼蟲死亡率分別為35.2%和33.1%（χ2=0.116，P＞0.05）。siRNA電穿孔處理后，siRNA-275處理組

21、、對(duì)照siRNA處理組和 PBS對(duì)照組幼蟲死亡率分別為33.1%、32.3%和31.9%（χ2=0.024，P＞0.05）。
　　7. TsNd基因沉默對(duì)旋毛蟲體外侵入IECs的影響
　?。?）浸泡法將20、30、40、50、60ng/μl dsRNA-TsNd導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)18h后，觀察幼蟲體外對(duì)IECs的侵入，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20、30、40、50、60ng/μl dsRNA-TsNd處理組、Lip2000和PBS對(duì)照組

22、幼蟲侵入率分別為54.4%，44.7%，39.2%，35.3%，32.7%，61.7%和63.1%。30、40、50、60ng/μl dsRNA-TsNd處理組幼蟲侵入率與Lip2000和PBS對(duì)照組相比明顯降低(χ230=6.640,χ240=10.982,χ250=16.778,χ260=19.317;P＜0.05)。幼蟲侵入率與dsRNA-TsNd濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.96798）。
　?。?）電穿孔法將20、30、40、

23、50、60ng/μl dsRNA-TsNd導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)后，觀察幼蟲體外對(duì) IECs的侵入，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20、30、40、50、60ng/μl dsRNA-TsNd處理組和 PBS對(duì)照組幼蟲侵入率分別為52.6%，43.8%，39.5%，33.8%，30.8%和58.3%。30、40、50、60ng/μl dsRNA-TsNd處理組幼蟲侵入率與PBS對(duì)照組相比明顯降低(χ230=4.258,χ240=7.044,χ250=12.95

24、6,χ260=16.099;P＜0.05)。幼蟲侵入率與dsRNA-TsNd濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.98707）。
　?。?）電穿孔法將1、1.5、2、2.5、3μM siRNA-275導(dǎo)入到旋毛蟲肌幼蟲后，觀察幼蟲體外對(duì)IECs的侵入，結(jié)果顯示1、1.5、2、2.5、3μM siRNA-275處理組、control siRNA處理組和PBS對(duì)照組幼蟲侵入率分別為50.3%，42.6%，37.0%，33.6%，30.6%，59.4

25、%和58.3%。1.5、2、2.5、3μM siRNA-275處理組幼蟲侵入率與control siRNA處理組和PBS對(duì)照組相比明顯降低(χ21.5=5.873,χ22=5.873,χ22.5=5.873,χ23=5.873;P＜0.05)。幼蟲侵入率與dsRNA-TsNd濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.97941）。
　　8. TsNd基因沉默對(duì)旋毛蟲侵入腸粘膜及其發(fā)育和生殖力的影響
　?。?）dsRNA浸泡法：dsRNA處理組

26、的成蟲荷（71.4±16.0條）明顯低于Lip2000對(duì)照組（140.2±14.9條）和PBS對(duì)照組（142.6±20.2條）（P<0.05）；Lip2000對(duì)照組的成蟲荷與PBS對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3組成蟲體外72h新生幼蟲產(chǎn)量分別為51.3±2.6、50.8±3.1及53.7±2.6（P＞0.05）。dsRNA處理組的肌幼蟲荷為5805±1815條/g，明顯低于Lip2000對(duì)照組的9363±3130條/g和

27、PBS對(duì)照組的9624±3624條/g（P<0.05）；而2個(gè)對(duì)照組肌幼蟲荷的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與PBS對(duì)照組相比，dsRNA處理組的成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為49.9%和39.9%。
　　（2）dsRNA電穿孔法：dsRNA處理組腸道成蟲荷為38.4±9.6條，明顯低于PBS對(duì)照組的113.5±18.8條（F=23.261，P<0.05）；2組成蟲體外72h新生幼蟲產(chǎn)量分別為72.3±6.1與78.3±6.9（P＞

28、0.05）。dsRNA處理組肌幼蟲荷為1943±97條/克，明顯低于PBS對(duì)照組的6376±1197條/克（F=42.475，P<0.05）。dsRNA處理組的成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為83.4%和69.5%。
　　dsRNA電穿孔法的成蟲與肌幼蟲減蟲率均明顯高于 dsRNA浸泡法（χ2成蟲=24.442,χ2肌幼蟲=17.419;P＜0.05）。
　?。?）siRNA電穿孔法：siRNA-275處理組的腸道成蟲荷為37.3±

29、10.2條，明顯低于對(duì)照 siRNA處理組的109.6±9.7條（P<0.05）和PBS對(duì)照組的102.5±20.1條（P<0.05），而對(duì)照 siRNA處理組與PBS對(duì)照組成蟲荷之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3組成蟲體外72h新生幼蟲產(chǎn)量分別為70.7±3.5、74.1±6.6及72.8±4.7（P＞0.05）。 siRNA-275處理組的肌幼蟲荷為1765±360條，明顯低于對(duì)照 siRNA處理組的6066±967條（P<

30、0.05）和 PBS對(duì)照組的5654±1422條（P<0.05），而對(duì)照 siRNA處理組與PBS對(duì)照組之間肌幼蟲荷的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA-275處理組的成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為63.6%和68.8%。
　　結(jié)論:
　　1．通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄成功合成了旋毛蟲dsRNA-TsNd和dsRNA-Tspst。
　　2．dsRNA浸泡法和電穿孔法均可導(dǎo)致TsNd轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平的下降，對(duì)TsNd基因的干擾具有特