RNAi沉默人唾液腺腺樣囊性癌SACC-83細胞bcl-2基因的研究.pdf

1、目的:
　　唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是唾液腺最為常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生于唾液腺的任何部位。腫瘤惡性程度高，容易沿神經(jīng)、血管浸潤性生長，術后常復發(fā)，也可發(fā)生肺、骨、腦和肝等遠處轉移。由于腫瘤的惡性生物學行為，直接威脅患者生命，目前術后尚無有效的治療方法。
　　B淋巴細胞瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，bcl-2)基因

2、是一種抑制細胞凋亡的癌基因，在眾多凋亡相關基因中bcl-2是目前最受關注的基因之一。定位于人的濾泡性淋巴瘤和正常B淋巴細胞染色體18號21區(qū)，含3個外顯子和2個內含子，可編碼26kD的bcl-2α和22kD的bcl-2β兩種蛋白，其中bcl-2α是抑制凋亡作用發(fā)揮的主要蛋白，為線粒體膜的整合蛋白。它最先是在人類濾泡型淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)，被認為是人類濾泡型淋巴瘤的細胞遺傳學標志，但后來研究發(fā)現(xiàn)，它在人類腫瘤中有廣泛意義。在許多腫瘤組織中，bcl

3、-2基因的表達水平通常會發(fā)生改變，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后有關。
　　RANi(RNA interference)即RNA干擾，是目前應用較廣的一種基因研究技術，是由外源或內源的雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）導入細胞而引起的與dsRNA同源的mRNA降解，從而抑制其相應的基因表達。RNAi具有高特異性、高效性、高穩(wěn)定性、可遺傳性、可擴散性和濃度時間依賴性等特點。利用RNAi技術，在RNA水平特異性抑

4、制特定基因的表達，使特定基因獲得功能性喪失，從而成為研究基因功能的良好工具。
　　本實驗采用RNA干擾（RNAi）技術特異性沉默人唾液腺腺樣囊性癌SACC-83細胞中的bcl-2基因，探討基因沉默后SACC-83細胞的形態(tài)變化及凋亡情況。
　　方法:
　　1重組腺病毒的構建與鑒定:武漢淅瑪生物技術公司受本實驗室委托，設計并構建重組腺病毒包裹的shRNA-bcl-2，使用雙酶切進行鑒定。
　　2細胞培養(yǎng):采用含15

5、％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人唾液腺腺樣囊性癌細胞株SACC-83。
　　3細胞轉染及滴度測定:將腺病毒介導的shRNA真核表達載體shRNA-bcl-2（沉默組）和shRNA-HK（陰性對照）轉染SACC-83細胞，沉默其bcl-2基因的表達（最佳腺病毒滴度MOI為腺病毒∶細胞=50∶1）;未轉染shRNA真核載體的SACC-83細胞（未轉染組）作為空白對照。
　　4bcl-2基因沉默效率的檢測:采用Real-T

6、ime PCR技術，從mRNA水平檢測基因沉默(RNAi)后SACC-83細胞中bcl-2基因的表達。
　　5細胞凋亡檢測:利用流式細胞術分別檢測SACC-bcl-2細胞、SACC-HK細胞、SACC-83細胞凋亡情況。
　　結果:
　　1成功構建重組腺病毒包裹的shRNA真核表達載體shRNA-bcl-2.
　　2腺病毒介導的shRNA真核表達載體shRNA-bcl-2轉染SACC-83細胞的轉染效率為98.1

7、8％; shRNA-HK轉染SACC-83細胞的轉染效率為94.10％。
　　3基因轉染48h后，Real-Time PCR時實定量檢測發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導的shRNA-bcl-2對SACC-83細胞中的bcl-2基因mRNA的沉默效率為90.19％。
　　4流式細胞術檢測SCCC-83-bcl-2組（沉默組）、SACC-83-HK組（空載體組）、SACC-83組（未轉染組），細胞凋亡率分別為8.45±0.25、4.26±0.2