BTBD7調(diào)控Slug誘導(dǎo)唾液腺腺樣囊性癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　唾液腺腺樣囊性癌(Salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是一種罕見的惡性腫瘤，僅占所有頭頸部腫瘤的1％。其特點(diǎn)是較高的局部侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，易轉(zhuǎn)移至肺、肝和骨骼。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者存活率低于未轉(zhuǎn)移者。目前，對(duì)于唾液腺腺樣囊性癌的治療尚無有效的解決方案，治療手段仍是以手術(shù)聯(lián)合放療或者化療的綜合治療為主，長(zhǎng)期的生存率偏低，治療效果不佳。由于缺乏具有特異性的腫瘤標(biāo)志物，SACC治療存在局限。隨

2、著對(duì)唾液腺腺樣囊性癌生物學(xué)行為和分子機(jī)制研究的不斷深入，能否找到更具有特異性的腫瘤標(biāo)記物對(duì)診斷和治療唾液腺腺樣囊性癌有重大的意義。
　　上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一個(gè)重要的生理病理過程，它導(dǎo)致大多數(shù)惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移過程中上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞。Slug是EMT的轉(zhuǎn)錄因子，具有鋅指結(jié)構(gòu)，在EMT進(jìn)程、癌細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移、維持干細(xì)胞的特征中發(fā)揮重要作用。SACC腫瘤組織中，Slug蛋白表達(dá)升高且在其侵犯神經(jīng)過程中Slug

3、沉默可下調(diào)EMMPRIN，上調(diào)E-鈣粘蛋白的表達(dá)，抑制EMT。
　　BTB域是在真核生物中存在的蛋白質(zhì)相互作用的基序。BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白7(BTBD7)含有保守的BTB/POZ蛋白交互作用基序，包含明顯的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，包括甲胎蛋白(AFP)1，CAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋β，GATA，激活蛋白等。近年來，BTBD7被認(rèn)為是促進(jìn)上皮組織重組和分支結(jié)構(gòu)器官形成的調(diào)控因子。局部BTBD7高表達(dá)會(huì)引起Slug、E-鈣粘蛋白的局部改變以

4、及提高上皮細(xì)胞能動(dòng)性。此外，BTBD7參與肺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程和肝細(xì)胞癌中的EMT。然而，BTBD7在唾液腺腺樣囊性癌(SACC)中的作用研究未見報(bào)道。
　　本研究通過免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)BTBD7和Slug在SACC組織中的表達(dá)情況，分析BTBD7的表達(dá)與臨床病理參數(shù)以及患者預(yù)后的關(guān)系，分析其表達(dá)在SACC中的意義;通過基因沉默技術(shù)，進(jìn)一步研究BTBD7沉默對(duì)高侵襲性SACC-LM腫瘤細(xì)胞體外侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖能力等生物學(xué)行為的影

5、響，采用qRT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)BTBD7沉默后Slug以及EMT相關(guān)基因的表達(dá)，探討B(tài)TBD7在SACC中的生物學(xué)機(jī)制，為SACC的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1、收集因病損手術(shù)切除的66例唾液腺腺樣囊性癌患者的組織蠟塊和15例正常的唾液腺組織蠟塊，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BTBD7及Slug蛋白在SACC組織和正常唾液腺組織中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢驗(yàn)BTBD7與Slug在SACC中表達(dá)的

6、相關(guān)性以及與患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、組織類型，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　2、Kaplan-Meier生存分析法分析BTBD7陽性與BTBD7陰性患者生存率的差異。COX多元比例風(fēng)險(xiǎn)分析探尋影響SACC患者生存的影響因素。
　　3、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)BTBD7及Slug在SACC-LM細(xì)胞及SACC-83細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　4、利用小干擾RNA技術(shù)沉默SACC-LM細(xì)胞中BTBD7基因的表達(dá)，qRT-PC

7、R技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)BTBD7、Slug以及EMT相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。
　　5、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)BTBD7基因沉默后SACC-LM細(xì)胞的遷移能力，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)果:
　　1.在唾液腺腺樣囊性癌組織中，BTBD7和Slug多為高表達(dá)，而在正常唾液腺組織中多為不表達(dá)或者低表達(dá)。BTBD7和Slug表達(dá)增高與SACC的T

8、NM分級(jí)，組織類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者的年齡、性別、腫瘤的大小無關(guān)。在唾液腺腺樣囊性癌組織中，BTBD7與Slug的陽性表達(dá)呈顯著正相關(guān)，在Slug陽性表達(dá)的組織中，BTBD7陽性表達(dá)率為70.2％(33/47)。
　　2.根據(jù)66位患有唾液腺腺樣囊性癌的患者術(shù)后隨訪結(jié)果，Kaplan-Meier生存曲線表明，BTBD7陽性表達(dá)的患者總體存活率顯著低于BTBD7陰性表達(dá)的患者。COX多元比例風(fēng)險(xiǎn)分析表明BTBD7陽性表達(dá)、Slu

9、g陽性表達(dá)和腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。BTBD7陽性表達(dá)的患者的生存風(fēng)險(xiǎn)是陰性表達(dá)患者的3.287倍。
　　3.免疫熒光染色顯示，BTBD7和Slug在SACC-LM和SACC-83細(xì)胞系中呈陽性表達(dá)。BTBD7陽性表達(dá)主要是位于兩種細(xì)胞的胞質(zhì)，Slug在兩種細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)。
　　4.qRT-PCR技術(shù)和Western bolt技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BTBD7基因沉默后，SACC-LM細(xì)胞中，BTBD7、S

10、lug、MMP9的mRNA及蛋白的表達(dá)顯著升高，相反，E-鈣粘連蛋白的mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低。
　　5.沉默BTBD7基因，明顯抑制SACC-LM細(xì)胞的遷移、侵襲能力，細(xì)胞的增殖能力未見明顯的影響。
　　結(jié)論:
　　在唾液腺腺樣囊性癌組織中，BTBD7陽性表達(dá)的患者生存率較低，預(yù)后差，預(yù)示其在SACC的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。在唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞系SACC-LM中，BTBD7基因沉默后能顯著提高Slug m