人小涎腺間充質(zhì)干細胞和上皮干-祖細胞分離鑒定及其構(gòu)建生物工程化唾液腺類器官的研究.pdf

1、研究背景及意義:
　　再生醫(yī)學的理念為口干癥的治療提供了新的思路，其中種子細胞的獲得和唾液腺功能重塑是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。小涎腺具有與大涎腺相似的結(jié)構(gòu)與功能，同時具有來源廣泛，取材方便與供區(qū)損傷小的優(yōu)點，是理想的成體干細胞來源。目前對于人小涎腺組織中的成體干細胞的研究很少，無詳細的報道。上皮一間質(zhì)共培養(yǎng)是經(jīng)典的體外組織構(gòu)建模式，可用于器官再生和發(fā)育研究。由人小涎腺來源種子細胞構(gòu)建生物工程化唾液腺類器官，將為疾病臨床治療和器官發(fā)育研究提供理論

2、基礎和技術(shù)支持。
　　研究目的:
　　1.由人小涎腺組織分離鑒定具有自我更新能力的成體干細胞，為構(gòu)建生物工程化唾液腺尋找種子細胞。
　　2.體外構(gòu)建具有功能的生物工程化唾液腺類器官，并探究其臨床應用的可能性。
　　研究內(nèi)容:
　　1.人小涎腺間充質(zhì)干細胞的分離與鑒定
　　方法: 用組織塊培養(yǎng)法對人小涎腺組織進行原代培養(yǎng)，用克隆環(huán)方法分離獲得紡錘樣間充質(zhì)干細胞，在體外擴增培養(yǎng)，獲得人小涎腺間充質(zhì)干細胞(

3、hMSGMSCs)。MTT法檢測細胞生長曲線，以及克隆形成實驗鑒定hMSGMSCs的自我更新能力。流式細胞術(shù)和細胞免疫熒光的方法鑒定hMSGMSCs的細胞表面標志物和特異蛋白的表達。對分離培養(yǎng)獲得的hMSGMSCs進行中胚層、內(nèi)胚層及外胚層方向的誘導分化，并將體外誘導獲得的骨、軟骨組織植入體內(nèi)觀察轉(zhuǎn)歸。構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型，觀察hMSGMSCs作為種予細胞進行細胞治療的可能性。
　　結(jié)果: 用組織塊原代培養(yǎng)方法可獲得紡錘樣間充質(zhì)

4、干細胞 hMSGMSCs，體外穩(wěn)定傳代至P20代，MTT法測定細胞群體倍增時間為66小時，克隆形成率為41.00±8.83％。流式細胞檢測得細胞陽性表達間充質(zhì)干細胞表面標志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，以及其它成體干細胞標志物SOX2、SSEA-1和Nestin。體外誘導后，hMSGMSCs可向中胚層骨、軟骨和脂肪細胞分化，相關(guān)基因RUNX2、SP7, BGLAP、SPP1;SOX9、ACAN、COL

5、2A1; PPARG與CEBPA表達升高，并有特殊染色鑒定細胞分化成熟，進一步體內(nèi)實驗證實誘導后hMSGMSCs在體內(nèi)有異位成骨、成軟骨的能力。對hMSGMSCs進行神經(jīng)細胞誘導后，可觀察到細胞出現(xiàn)神經(jīng)細胞形態(tài)，與NES，GFAP和TUBB3的基因相對表達水平顯著升高。對hMSGMSCs進行成肝細胞誘導，可觀察到細胞形態(tài)向卵圓形轉(zhuǎn)變，誘導過程中觀察到內(nèi)胚層前體細胞標志物FOXA2、SOX17和CXCR4先升高后降低，肝細胞標志物AFP,

6、 ALB和KRT18持續(xù)升高，誘導后細胞免疫熒光檢測驗證蛋白陽性表達。對肝損傷動物模型進行尾靜脈hMSGMSCs細胞移植，2周后取材可見肝內(nèi)存在標記細胞的陽性信號，免疫熒光共染可見陽性共表達新生肝細胞標記物AFP等。
　　結(jié)論: 由人小涎腺組織塊原代培養(yǎng)法可獲得具有自我更新和多向分化能力的間充質(zhì)干細胞hMSGMSCs。該細胞陽性表達間充質(zhì)干細胞表面標志物和一些成體干細胞標志物。以其作為種子細胞可在體內(nèi)異位成骨、成軟骨，移植入急性肝

7、損傷小鼠體內(nèi)后可以觀察到細胞定植和分化，提示其應用于臨床細胞治療的可能性。
　　2.基因表達譜比較分析人小涎腺間充質(zhì)干細胞與其他組織來源MSC
　　方法: 原代培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞至P3代，與上文研究中獲得的P3代hMSGMSCs進行比較，收集細胞RNA，進行全基因組表達譜芯片檢測。對芯片結(jié)果進行比較，獲得差異表達基因，進行聚類分析和GO、KEGG信號通路比對綜合分析差異基因的作用。
　　結(jié)果: 統(tǒng)

8、計分析芯片數(shù)據(jù)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，hASCs與hMSGMSCs相比，387基因上調(diào)，533基因下調(diào);hBMSCs與hMSGMSCs相比，234基因上調(diào)，192基因下調(diào)。對其中差異值較大的257個基因進行分層聚類發(fā)現(xiàn)，hMSGMSCs與hASCs更易聚類。GO基因功能注釋和KEGG Pathways在線數(shù)據(jù)庫對這些hMSGMSCs特異性上調(diào)或下調(diào)的基因進行綜合分析，可以發(fā)現(xiàn)這些基因主要與免疫反應、受體結(jié)合和胞外區(qū)功能相關(guān)，而富集的信號通路包括細胞

9、因子受體相互作用、化學因子信號通路和NOD樣受體信號通路。
　　小結(jié): 三種問充質(zhì)干細胞全基因組表達譜分析結(jié)果顯示，hMSGMSCs與hASCs更易聚類，差異基因聚類于免疫反應、受體結(jié)合和胞外區(qū)功能，富集的信號通路包括細胞因子受體相互作用、化學因子信號通路和NOD樣受體信號通路。
　　3.人小涎腺上皮來源干/祖細胞分離與立體培養(yǎng)研究
　　方法: 組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人小涎腺上皮來源干/祖細胞(hMSGSCs)， MTT

10、法檢測細胞生長曲線，以及克隆形成實驗鑒定hMSGSCs的自我更新能力。流式細胞術(shù)和細胞免疫熒光的方法鑒定hMSGSCs的細胞表面標志物和特異蛋白的表達。在Matrigel中對hMSGSCs進行立體培養(yǎng)，觀察激活不同信號通路對hMSGSCs的影響。
　　結(jié)果: 用組織塊培養(yǎng)方法由人小涎腺組織分離培養(yǎng)獲得鋪路石樣上皮干/祖細胞，在體外穩(wěn)定傳代至P25代。MTT法測得細胞群體倍增時間為39.71小時，克隆形成率為10.7％±3.0％。在

11、體外傳代過程中發(fā)現(xiàn)干細胞相關(guān)基因LGR5等表達升高，且能自發(fā)發(fā)生分化，導管細胞標志物KRT19和腺泡細胞標志物AMY1B和MUC5B均升高。立體培養(yǎng)體系中，hMSGSCs干細胞特性得到保留，并且發(fā)現(xiàn)通過激活經(jīng)典Wnt通路和抑制BMP信號可以促進hMSGSCs中干細胞自我更新，抑制分化。
　　結(jié)論: 人小涎腺組織中存在上皮來源成體干細胞hMSGSCs，具有高度自我更新能力，可分化為導管和腺泡細胞，Wnt和BMP信號通路參與調(diào)控hMS

12、GSCs自我更新與分化。
　　4.體外構(gòu)建生物工程化唾液腺類器官的研究
　　方法: 分別用GFP與RFP標記hMSGSCs與hMSGMSCs，后按1∶1比例在Matrigel中混合共培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學變化，收集形成的生物工程化類器官體進行基因表達檢測和免疫熒光檢測。同時，將體外培養(yǎng)3天后的唾液腺類器官體，移植入唾液腺切除小鼠模型體內(nèi)，2周后取材觀察生物工程化唾液腺類器官體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸。
　　結(jié)果: hMSGSCs與hM

13、SGMSCs接種至Matrigel中3天后可以觀察到兼有導管和腺泡結(jié)構(gòu)的類器官體形成，而單獨hMSGSCs接種則不能形成這種帶有導管分支樣結(jié)構(gòu)的類器官體。由熒光蛋白標記細胞后，可以觀察到形成類器官體中導管和腺泡結(jié)構(gòu)均來自hMSGSCs。共培養(yǎng)所得類器官基因表達中成熟導管上皮細胞標志物KRT19和腺泡上皮細胞標志物AMY1B, MUC5B顯著高于hMSCSCs單獨構(gòu)建組，且LGR5表達水平未降低。組織學檢測顯示PAS陽性表達于類器官，且類

14、器官中導管樣結(jié)構(gòu)CK15陽性，腺泡樣細胞表達CK14。類器官體植入體內(nèi)后2周，檢測到類器官體表現(xiàn)出更為成熟的組織形態(tài)，上皮細胞排列更整齊，并且可以檢測到CK19和CK14陽性。
　　結(jié)論: 用hMSGSCs與hMSGMSCs共培養(yǎng)的方法可以獲得具有導管分支結(jié)構(gòu)的生物工程化唾液腺類器官體，體內(nèi)實驗證實生物工程化唾液腺類器官移植具有臨床可操作性。
　　總結(jié):
　　綜上所述，本研究中以人小涎腺組織為來源，分離獲得小涎腺間充質(zhì)