骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化氣管模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，將豬間充質(zhì)干細(xì)胞白骨髓血中分離出來(lái)，進(jìn)一步在體外的培養(yǎng)，并誘導(dǎo)其向軟骨樣細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化，探討其作為組織工程化氣管種子細(xì)胞的可能性。 方法：收集豬骨髓血，采用密度梯度離心和貼壁生長(zhǎng)的方式，提取單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；觀察其生長(zhǎng)方式；收集第2～3代(P2～P3)細(xì)胞用含10ug/L TGF-β1的DMEM-HG培養(yǎng)液誘導(dǎo)、分化為軟骨樣細(xì)胞；用含COL-I(濃度25mg/L)

2、、乙酸(濃度0.1％)的培養(yǎng)液向呼吸道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)、分化；用含10ng/mL VEGF的培養(yǎng)液誘導(dǎo)、分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞；對(duì)所誘導(dǎo)、分化的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和RT-PCR檢測(cè)、免疫組化以及相關(guān)抗原的免疫熒光鑒定。 結(jié)果：通過(guò)密度梯度離心和貼壁生長(zhǎng)的方法，可以獲取具有一定形態(tài)特點(diǎn)、貼壁生長(zhǎng)、增殖活躍的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；豬BMMSCs在含10ug/L TGF-β1的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)紫紅色異染出現(xiàn)

3、；RT-PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原mRNA呈陽(yáng)性表達(dá)；免疫組化檢查Ⅱ型膠原為陽(yáng)性；BMMSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后免疫組化顯示細(xì)胞角蛋白陰性；BMMSCs在含VEGF(10ng/mL)的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)，細(xì)胞形態(tài)也逐漸發(fā)生變化，2w后，外觀呈現(xiàn)為鵝卵石樣形態(tài)，胞漿豐富，免疫表型顯示細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)vWF。 結(jié)論：1、用密度梯度離心和貼壁的方法可以得到數(shù)量較多的豬BMMSCs，可以提供組織工程化氣管所需的種子細(xì)胞：2、豬BMMSCs可以在體外誘導(dǎo)分化為軟