以脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程脂肪的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前軟組織缺損應(yīng)用的填充材料最廣泛的是固體硅膠和自體脂肪顆粒移植，其中后者由于效果好，來(lái)源豐富，無(wú)排異反應(yīng)，但其吸收率高達(dá) 60-70﹪，如何克服其不足，則在每年眾多的隆乳術(shù)和軟組織填充術(shù)中，使用具有生命力的脂肪組織作填充物是最好的選擇。組織工程學(xué)的發(fā)展為其帶來(lái)新的希望。 組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，研究開(kāi)發(fā)能夠修復(fù)，維持或改善損傷組織形態(tài)和功能的生物替代物的一門(mén)科學(xué)。組織工程化脂肪是利用組織工程技術(shù)，將具有活性的脂

2、肪細(xì)胞種植于可降解的支架上，制造出一種與受體組織相容性好、無(wú)免疫原性、有活力、耐久性長(zhǎng)、可塑性強(qiáng)的人工脂肪。這種理想的脂肪具有自我修復(fù)能力，能為正在成長(zhǎng)的患者提供增長(zhǎng)能力，從而提高移植脂肪的長(zhǎng)期療效。組織工程學(xué)的發(fā)展為組織帶來(lái)了新希望，同時(shí)為新型整形美容專業(yè)充填材料的開(kāi)發(fā)和改進(jìn)指明了方向。 組織工程技術(shù)包括：種子細(xì)胞的獲取，種子細(xì)胞均勻種植于三維支架，形成細(xì)胞一支架復(fù)合物，共同進(jìn)行培養(yǎng)，組織工程脂肪的體外構(gòu)建及動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)觀察，

3、本實(shí)驗(yàn)將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)后種植于PLZA三維支架，形成脂肪細(xì)胞一可降解三維支架復(fù)合物，構(gòu)建組織工程脂肪，并作為填充材料移植于兔背部皮下組織。在不同時(shí)間點(diǎn)，從大體、組織染色及掃描電鏡觀察組織工程脂肪的形成情況。 目的：1．了解體外培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及其體外成脂和成骨的能力。2．研究低溫凍存對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞其生物學(xué)特性的影響，探討MSCs理想的保存方法。3．本研究在分離純化、大量擴(kuò)增人脂肪問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞

4、的基礎(chǔ)上，通過(guò)凍存后鑒定其生物學(xué)特性有無(wú)變化，以探討這種冷凍方法的可行性。4．研究人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在可降解骨基質(zhì)材料聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)上的黏附、增殖和分化能力，為進(jìn)一步體內(nèi)回植提供研究基礎(chǔ)。5．研究以PLGA為支架材料形成的組織工程脂肪作為軟組織填充材料的可行性。 方法：1．體外培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代計(jì)數(shù)，行成骨和成脂誘導(dǎo)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞增殖周期與表面分子。2．體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增正常成人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在

5、5﹪DMSO-30﹪FBS-DMEM凍存保護(hù)劑條件下，采用二步法低溫保存3月，以臺(tái)盼藍(lán)拒染回收率(TBR)、ADSCs生長(zhǎng)曲線、ADSCs表面抗原表達(dá)以及其多向分化能力檢測(cè)，比較凍存對(duì)ADSCs生物學(xué)特性的影響。3．用常規(guī)方法體外培養(yǎng)并擴(kuò)增人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，消化細(xì)胞并洗滌離心加入10﹪二甲基亞砜、30﹪胎牛血清、60﹪MEM的細(xì)胞凍存體系，直接放入-70﹪冰箱貯存。凍存4、8和12周在37℃水浴復(fù)溫，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞表型和成脂的

6、多向分化潛能，4．等比混合聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)，有機(jī)溶劑注模法制備PLGA。體外培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，復(fù)合PLGA，通過(guò)掃描電鏡觀察人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA上的黏附、增殖，以及在成脂誘導(dǎo)情況下細(xì)胞形態(tài)的變化。5．實(shí)驗(yàn)組：取兔的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，行體外擴(kuò)增培養(yǎng)第3代，達(dá)到一定數(shù)量后成脂誘導(dǎo)1周，接種于PLGA支架上，繼續(xù)誘導(dǎo) 1 周，置于兔背部肩胛骨兩側(cè)皮下，分別于4、8周從大體和組織學(xué)方面觀察脂肪形成情況；對(duì)照組：

7、單純以未接種細(xì)胞的支架移植于兔背部肩胛骨兩側(cè)皮下，于相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：1．人脂肪干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)均一的陽(yáng)性表達(dá)CD44、CD106，而CD49d、CD34、CD45和HLA-DR表達(dá)陰性。細(xì)胞周期分析表明：G<,0>/G<,1>、S和G<,2>/M所占比例分別為79.1﹪、19.7﹪和1.3﹪。分離細(xì)胞在誘導(dǎo)體系下可以向成骨和成脂方向分化。2．凍存后ADSCs的增殖能力和向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化沒(méi)有顯著影響，與凍存前

8、比較，P>0.05。3．消化后不經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的程序性降溫凍存技術(shù)，直接-70℃冰箱貯存，其細(xì)胞生物學(xué)特性無(wú)明顯改變，細(xì)胞仍存在成脂的多向分化潛能。4．合成的PLGA呈多孔狀，孔隙率為85﹪，孔徑為100～400 um。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可在PLGA上黏附、增殖、分泌胞外基質(zhì)，并可在成脂誘導(dǎo)劑的作用下分化為圓形的成脂樣細(xì)胞。復(fù)合后14天，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和胞外基質(zhì)已將基質(zhì)材料顆粒完全覆蓋。 5．實(shí)驗(yàn)組植入4周后該復(fù)合物在支架中有脂肪形成，并

9、可見(jiàn)細(xì)胞突入支架材料中；8周后支架材料繼續(xù)降解，脂肪組織形成明顯，伴有少量血管長(zhǎng)入。對(duì)照組支架材料逐漸崩解，未見(jiàn)脂肪組織形成。 結(jié)論：1．脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有特殊的生物學(xué)特點(diǎn)，體外能夠向成骨和成脂方向分化。2．采用5﹪DMSO-30﹪FBS-DMEM凍存保護(hù)液和二步法的凍存體系，可較完整保持ADSCs生物學(xué)特性，是深低溫保存ADSCs的理想方案。3．人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞懸液直接-70℃冰箱貯存不影響其生物學(xué)特性，是冷凍保存一種可行