骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合內(nèi)皮祖細胞構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)化組織工程化心肌.pdf

1、目的：
　　分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)，應(yīng)用BMSCs聯(lián)合不同比例EPCs與脫細胞牛心包體外構(gòu)建具有血管網(wǎng)絡(luò)化的工程化心肌樣組織，并將聯(lián)合構(gòu)建的各組工程化心肌樣組織植入裸鼠體內(nèi)，檢測微血管網(wǎng)絡(luò)的形成。論證聯(lián)合應(yīng)用大鼠BMSCs和EPCs體外構(gòu)建具有血管化網(wǎng)絡(luò)的工程

2、化心肌樣組織的可行性，及植入體內(nèi)后生成的新生血管網(wǎng)絡(luò)功能的有效性，并探討 BMSCs/EPCs聯(lián)合應(yīng)用的促進血管網(wǎng)絡(luò)化形成的最佳比例。
　　方法：
　　第一部分：分離、培養(yǎng) BMSCs，經(jīng)流式對其進行鑒定。應(yīng)用 AngII將 BMSCs向心肌細胞定向誘導(dǎo)分化，對照組未添加誘導(dǎo)劑，采用MTT法檢測各組細胞增殖曲線，并通過與對照組的對比計算不同濃度誘導(dǎo)組的細胞增殖抑制率。采用免疫熒光法檢測各誘導(dǎo)組及對照組第1、4周心肌特異蛋白

3、cTnT、β-MHC的表達，并計算細胞轉(zhuǎn)化率。RT-PCR檢測不同濃度AngII誘導(dǎo)組細胞培養(yǎng)4周時表達心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2-5的情況。
　　第二部分：分離、培養(yǎng)EPCs，通過免疫熒光法檢測細胞表型vWF、FLK-1、CD34、CD133的表達，鑒定所獲細胞為EPCs。用去污劑-酶消化法對新鮮牛心包進行脫細胞處理，并通過 HE染色、SEM對其脫細胞前后的形態(tài)學及表面情況變化進行觀察，計算脫細胞效率。將AngII誘

4、導(dǎo)培養(yǎng)4周的BMSCs，聯(lián)合第1代EPCs與脫細胞牛心包生物支架材料進行體外復(fù)合培養(yǎng)，HE染色、SEM觀察細胞在脫細胞牛心包上的形態(tài)及黏附生長情況。然后將體外構(gòu)建的細胞/支架材料移植于裸鼠背部皮袋內(nèi)，術(shù)后1、4周手術(shù)尋回植體，行HE染色、免疫組織化學染色及RT-PCR對微血管及心肌特異蛋白、基因進行檢測，并觀察構(gòu)建的工程化心肌內(nèi)部血管網(wǎng)絡(luò)組織形成情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分：原代培養(yǎng)的BMSCs5～6天細胞開始成簇生長，

5、形態(tài)為長梭形及多角形，呈旋渦狀排列。12～14天細胞長成單層。流式檢測細胞CD29表達陽性，CD45表達陰性。AngII各誘導(dǎo)組間的細胞增殖曲線相似，0.05μmol/L組細胞增殖抑制率于第5天出現(xiàn)負值，與其他組有顯著性意義(P＜0.05)。第5，7天0.1μmol/L組細胞增殖抑制率明顯低于0.2，0.5μmol/L組(P＜0.05)。各誘導(dǎo)組的BMSCs均可表達cTnT、β-MHC。誘導(dǎo)1周，0.5μmol/L組cTnT、β-MHC

6、蛋白陽性表達率明顯高于0.05μmol/L組(P＜0.05)。誘導(dǎo)4周，0.1μmol/L組與0.2μmol/L組兩種蛋白陽性表達率均相似(P＞0.05)。對照組于1,4周表達均為陰性。誘導(dǎo)4周，經(jīng)RT-PCR檢測各誘導(dǎo)組BMSCs均可表達轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5，對照組表達陰性。
　　第二部分：原代EPCs培養(yǎng)至7天左右逐漸出現(xiàn)貼壁細胞，第18天細胞融合可達80％，傳代后子代細胞單層生長，鋪路石樣排列，增殖力旺盛。第1

7、代細胞經(jīng)免疫熒光化學染色檢測vWF、FLK-1及CD34、CD133均為陽性。新鮮的牛心包經(jīng)去污劑-酶聯(lián)合四步法脫細胞處理和交聯(lián)劑京尼平溶液固定后，HE染色觀察脫細胞處理的效率接近100%。SEM檢測其超微結(jié)構(gòu)：脫細胞處理后的牛心包表明無細胞殘留且表面排列雜亂，放大后可見有2μm小孔。新鮮牛心包表明覆蓋有排列致密的細胞層。三組細胞在處理后牛心包支架材料上培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量逐步增加，經(jīng)SEM觀察發(fā)現(xiàn)三組細胞在材料上黏附良好

8、。將細胞/支架材料植入裸鼠后，傷口無紅腫、滲液，于第一周時I期愈合。1周各植入組植入物取回后發(fā)現(xiàn)大小無明顯變化，呈深藍色，質(zhì)地略硬，未見明顯包膜。HE染色結(jié)果示：術(shù)后4周，各組植入物取回后顏色深藍色，各組植入物表面有明顯血管長入，且支架材料的周邊潤滑圓頓。BMSCs/EPCs組支架材料血管長入較BMSCs組及EPCs組明顯，且周圍血管豐富；BMSCs/EPCs的比例對血管的生成有一定影響，最佳比例為80:20。
　　結(jié)論：

9、　　(1)體外可以經(jīng)大鼠骨髓分離、培養(yǎng)獲得BMSCs和EPCs。
　　(2)經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)的BMSCs表達心肌特異蛋白cTnT、β-MHC及轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5，且誘導(dǎo)分化適宜濃度為0.1μmol/L。
　　(3)去污劑－酶聯(lián)合四步法脫細胞處理牛心包，去細胞率可達100%， BMSCs/EPCs可與其良好粘附，可以成為構(gòu)建工程化心肌的良好支架。
　　(4) BMSCs/EPCs是構(gòu)建心肌/血管組織工程的種