HIF-1α-BNIP3信號通路調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬在唾液腺腺樣囊性癌中的作用.pdf

1、唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是頭頸部唾液腺最常見的惡性腫瘤之一，具有嗜神經(jīng)生長、遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率高及易發(fā)生全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等獨(dú)特的生物學(xué)行為。因此，腺樣囊性癌曾被描述為頭頸部最具破壞性和不可預(yù)見性的腫瘤之一。目前，對于腺樣囊性癌尚無行之有效的治療方案，主要的治療手段是手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療為主，近年來有術(shù)后行I125放射性粒子植入作為輔助放療的報(bào)道。雖然5年生存率較高，但其10

2、年甚至更長時間生存率偏低，效果并不滿意。因此，進(jìn)一步了解腺樣囊性癌的生物學(xué)行為和分子遺傳學(xué)特征可能找提供新的見解和治療策略。近年來隨著對腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)腺樣囊性癌的治療要想取得突破性進(jìn)展，需要尋找更具針對性的新目的基因，通過基因轉(zhuǎn)染抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，是腫瘤基因治療策略之所在。
　　低氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境中常見的現(xiàn)象。腫瘤在高速增殖的過程中，血管生成速度顯著低于細(xì)胞增殖速度，氧供應(yīng)

3、的速度滯后于細(xì)胞對氧的需求，現(xiàn)已有大量研究表明低氧狀態(tài)與腫瘤的侵襲性、血管再生、提高復(fù)發(fā)率及放化療耐受性之間存在復(fù)雜的聯(lián)系。作為氧平衡的重要調(diào)節(jié)因子，HIF-1是在低氧條件下重要的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩種亞基組成的異源二聚體，HIF-1β是HIF-1的結(jié)構(gòu)性亞基，在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)相對穩(wěn)定;HIF-1α是HIF-1的功能亞基，常氧條件下不斷合成，同時不斷經(jīng)泛素-蛋白酶小體途徑水解。低氧條件下，HIF-1α降解受

4、阻，在細(xì)胞漿內(nèi)積聚增多，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與HIF-1β結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-1α已經(jīng)在大多數(shù)常見的人類癌癥中觀察到，如頭頸部的惡性腫瘤、卵巢癌和食道癌中，并與不良預(yù)后及治療抵抗相關(guān)。Costa等發(fā)現(xiàn)HIF-1a廣泛的在唾液腺腺樣囊性癌中表達(dá)，而在腫瘤附近正常唾液腺腺體組織鮮有表達(dá)。
　　BNIP3，即Bcl2/腺病毒E1B19 kDa相關(guān)蛋白3(BCL2/adenovirus E1B19kDa interacting pr

5、otein3)，屬于促凋亡蛋白，其表達(dá)受HIF-1α依賴的缺氧的調(diào)節(jié)及其他很多因素的影響。BNIP3蛋白主要定位于線粒體外膜，當(dāng)其被激活后，完全整合入線粒體外膜，通過開放線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrialpermeability transition pore，MPTP)損傷線粒體功能引起染色質(zhì)凝聚、DNA分解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年來，BNIP3的異常表達(dá)和很多腫瘤的進(jìn)展、化療耐藥及自噬密切相關(guān)。BNIP3的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因

6、子HIF-1a的調(diào)控，在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡過程中起重要的作用。然而，唾液腺腺樣囊性癌中BNIP3的表達(dá)、其調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬通路及臨床病理學(xué)行為國內(nèi)外尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　自噬指的是從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹的部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需要降解的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等形成自噬體，與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，進(jìn)一步降解所包裹的多余蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞成分，來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新，來維持自身的穩(wěn)定。其整個過程主要分3

7、個階段:自噬小體的初步形成;自噬體膜的延伸;自噬體與溶酶體融合并降解。氯喹可以通過升高溶酶體內(nèi)的PH值，進(jìn)而阻止自噬體與溶酶體結(jié)合而抑制自噬。我們的研究團(tuán)隊(duì)在之前調(diào)查過79名患有頭頸部腺樣囊性癌的患者，觀察自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈-3（microtubule associated protein1 light chain3，LC3）和Beclin1的表達(dá)，結(jié)果顯示二者在腺樣囊性癌形成的過程中起重要的作用。近期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)

8、與誘導(dǎo)自噬之間存在某些聯(lián)系，然而低氧誘導(dǎo)腺樣囊性癌細(xì)胞自噬的分子機(jī)制尚未完全明確。
　　目的:
　　1、應(yīng)用二氯化鈷在體外構(gòu)建細(xì)胞低氧模型，采用經(jīng)其處理的腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-M細(xì)胞，模擬其在體內(nèi)的缺氧環(huán)境，觀察缺氧條件下低氧相關(guān)的HIF-1α/BNIP3通路相關(guān)基因、自噬相關(guān)基因LC3、Beclin1在腺樣囊性癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討低氧對唾液腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞增殖和自噬的影響。
　　2、采用二氯化鈷模擬低

9、氧條件，研究低氧誘導(dǎo)的自噬對唾液腺腺樣囊性癌ACC-M侵襲性的影響，研究氯喹通過抑制低氧誘導(dǎo)的自噬過程而對ACC-M細(xì)胞侵襲性的影響。
　　方法:
　　1、應(yīng)用二氯化鈷作為化學(xué)性低氧誘導(dǎo)劑，體外構(gòu)建唾液腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞低氧模型。
　　2、MTT法對ACC-M細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力測驗(yàn)，以檢測二氯化鈷對細(xì)胞增殖的抑制作用;透射電子顯微鏡觀察自噬體形成;雙免疫熒光標(biāo)記、RT-PCR及Western blot檢測低氧相關(guān)

10、HIF-1α/BNIP3通路相關(guān)基因、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈-3(microtubule associated protein1 light chain3,LC3)及Beclin1的表達(dá)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行two-tailed t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有顯著性。
　　3、觀察比較經(jīng)二氯化鈷處理的ACC-M細(xì)胞和常氧狀態(tài)下培養(yǎng)的細(xì)胞的侵襲能力;然后用氯喹(10μ M and20μ M

11、)處理實(shí)驗(yàn)組ACC-M細(xì)胞，通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來對比實(shí)驗(yàn)組與對照組中癌細(xì)胞的侵襲能力。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行two-tailed t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:
　　1、二氯化鈷可以降低ACC-M細(xì)胞的活性，同時可以誘導(dǎo)自噬體的形成;透射電子顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)可見到自噬體樣的雙層膜結(jié)構(gòu);RT-PCR及Western blot檢測顯示二氯化鈷可明顯使HIF-1α/BNIP3

12、信號通路的相關(guān)基因和自噬的表達(dá)顯著提高。
　　2、與對照組相比，經(jīng)過二氯化鈷處理的ACC-M細(xì)胞在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對照組(p＜0.001);而后在經(jīng)氯喹處理細(xì)胞侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，且劑量越高抑制作用越明顯(p＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、二氯化鈷可以模擬低氧環(huán)境，從而誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞自噬現(xiàn)象的產(chǎn)生，同時HIF-1α/BNIP3信號通路在這個過程中扮演重要的角色。
　　2、二氯化鉆可