HIF-1α介導(dǎo)的ROCK信號(hào)通路在人參皂苷Rb1保護(hù)醋酸鉛誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　以醋酸鉛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷為模型，探討低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）介導(dǎo)的ROCK信號(hào)通路在人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1,Gs-Rb1）保護(hù)醋酸鉛誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞PC12損傷中的作用。
　　方法：
　　第一部分將體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞用不同劑量的醋酸鉛染毒后，篩選出可產(chǎn)生明顯損傷PC12細(xì)胞的醋酸鉛低、中、高劑量組，各藥物作用于細(xì)胞

2、24 h后，采用噻唑藍(lán)還原法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖率的影響，乳酸脫氫酶LDH釋出率試劑盒檢測(cè)PC12細(xì)胞的損傷程度，采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中丙二醛（malondialdehvde,MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）水平，DCFH-DA探針染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量，采用ATP試劑盒熒光素酶法來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量，倒置相差顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變

3、化，Hoechst33342染料檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，以及免疫熒光染色法檢測(cè)HIF-1α、Rho關(guān)聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶-2（rho associated coiled coil forming protein Kinase-2,ROCK-2）在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞HIF-1α、Rho關(guān)聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶-1（rho associated coiled coil forming protein Kinase-1,ROCK-1）、R

4、OCK-2、線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C（mitochondrial cytochrome C,Cyto C）、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9,Caspase-9）、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3）、淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lew

5、kmia-2，Bcl-2）以及Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，Bax）的表達(dá)。然后再采用小RNA干擾HIF-1α，觀察對(duì)細(xì)胞中HIF-1α、ROCK-1，ROCK-2蛋白表達(dá)的變化。第二部分選擇合適劑量的醋酸鉛處理 PC12細(xì)胞造成細(xì)胞損傷模型，同時(shí)給予不同劑量的人參皂苷 Rb1或HIF-1α特異性抑制劑二甲基雌二醇（2ME2）預(yù)處理，采用以上相同方法，檢測(cè)細(xì)胞增殖率、LDH、SOD、ROS、

6、ATP、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞凋亡，以及HIF-1α、ROCK-1、ROCK-2、Cyto C、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白等指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：
　　PC12細(xì)胞隨著醋酸鉛劑量的增大損傷加重，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。同時(shí)，損傷的PC12細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量明顯提高，軸突縮短，細(xì)胞活力下降，皺縮變圓出現(xiàn)凋亡。此外，醋酸鉛可使PC12細(xì)胞HIF-1α，ROCK-2表達(dá)上調(diào)，并從胞質(zhì)向細(xì)胞核聚集轉(zhuǎn)位

7、；同時(shí)使ROCK-1、ROCK-2、Cyto C、Caspase-9及Caspase-3的表達(dá)上調(diào)，Bax/Bcl-2的表達(dá)比例也顯著增加；HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞中HIF-1α，ROCK-1，ROCK-2的蛋白表達(dá)水平下降。人參皂苷Rb1及HIF-1α抑制劑2ME2可減輕醋酸鉛對(duì)PC12細(xì)胞損傷的程度，下調(diào)HIF-1α、ROCK-1、ROCK-2、Cyto C、Caspase-9、Caspase-3以及Bax/Bcl-2