PINK1介導(dǎo)Bnip3磷酸化及其對(duì)線粒體自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、帕金森病（Parkinson's Disease，PD）是一種最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)障礙疾病，其發(fā)生率在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中排名第二，僅次于老年癡呆癥，在我國(guó)65歲以上人群中的發(fā)病率約為1.7％。PD病理表現(xiàn)為中腦黑色致密部多巴胺能神經(jīng)元的選擇性丟失以及神經(jīng)元中異常蛋白聚集或路易小體的形成。通過(guò)對(duì)PD病人的致病突變分析，目前鑒定了16個(gè)PD致病基因。其中多個(gè)基因被報(bào)道與線粒體的功能調(diào)節(jié)相關(guān)，這提示線粒體與PD發(fā)病存在相關(guān)性。PINK1突變會(huì)導(dǎo)

2、致常染色體隱性遺傳的PD。該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種線粒體膜定位的磷酸激酶，對(duì)維持線粒體的穩(wěn)態(tài)和功能具有重要作用。然而目前對(duì)PINK1磷酸化底物的研究報(bào)道并不多。前期的質(zhì)譜結(jié)果提示，Bnip3可能是PINK1的磷酸化底物，磷酸化位點(diǎn)為Bnip3 S95區(qū)域。Bnip3是Bcl-2家族中BH3-only亞家族成員蛋白，主要定位于線粒體外膜，當(dāng)細(xì)胞處于缺氧環(huán)境時(shí)表達(dá)上調(diào)。Bnip3的高表達(dá)可以引起線粒體自噬，而干擾Bnip3會(huì)抑制線粒體自噬從

3、而降低細(xì)胞的抗逆性。而研究PINK1與Bnip3的線粒體功能調(diào)控關(guān)系，能有助于我們發(fā)現(xiàn)新的PINK1激酶調(diào)控通路。
　　目的:研究PINK1介導(dǎo)Bnip3磷酸化及其對(duì)線粒體自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:1.通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們檢測(cè)PINK1與Bnip3是否存在相互作用，同時(shí)PINK1的激酶失活突變G309D與D384N是否影響兩者的相互作用。
　　2.外源表達(dá)PINK1野生型和激酶失活突變體并用CCCP處理，檢測(cè)內(nèi)源

4、性Bnip3蛋白水平。及檢測(cè)PINK1激酶活性的增加及CCCP處理后是否影響了內(nèi)源性Bnip3的蛋白水平。
　　3.為研究PINK1磷酸化Bnip3的對(duì)Bnip3的功能調(diào)控作用，我們構(gòu)建并表達(dá)Bnip3模擬磷酸化和模擬去磷酸化突變體Bnip3 S94D和Bnip3 S95A，以及擴(kuò)大化磷酸突變區(qū)域的Bnip3 S92/93/95A和Bnip3 S92/93/95D突變體，通過(guò)免疫共沉淀以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Bnip3的95位絲氨酸