口蹄疫病毒VP1抑制TPL2介導(dǎo)的IRF3磷酸化功能研究.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的一種烈性、急性和高度傳染性疾病，主要感染羊、牛、豬等偶蹄動(dòng)物。FMDV感染宿主細(xì)胞拮抗宿主免疫應(yīng)答，進(jìn)而得以在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量復(fù)制。在抵抗病毒早期感染過(guò)程當(dāng)中，天然免疫處于非常關(guān)鍵的位置，是宿主抵御病毒入侵的第一道防線。
　　TPL2(tumor progression locus

2、2)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAP3K蛋白激酶家族，又稱大阪甲狀腺癌激酶(Cancer Osaka thyroid，Cot)或絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶8(MAPKkinase kinase8，MAP3K8)，可以在調(diào)控宿主干擾素和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在天然免疫和適應(yīng)性免疫過(guò)程中扮演重要角色。TPL2在病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原感染中發(fā)揮重要作用。
　　為探索TPL2與FMDV是否具有相互作用，通過(guò)免疫共沉淀和間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)

3、發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2以及非結(jié)構(gòu)蛋白L和宿主蛋白TPL2互作。熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)TPL2可促進(jìn)IRF3介導(dǎo)的IFN-β信號(hào)通路活化并且呈現(xiàn)劑量依賴性;通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)TPL2，發(fā)現(xiàn)TPL2能夠促進(jìn)IRF3的磷酸化。構(gòu)建TPL2一系列的關(guān)鍵性功能位點(diǎn)突變的突變體，隨后通過(guò)轉(zhuǎn)染驗(yàn)證其表達(dá);將TPL2(T290A)突變體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)IRF3介導(dǎo)的IFN-β信號(hào)通路無(wú)活化作用。同時(shí)將FMDV的VP

4、1質(zhì)粒和TPL2質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染，熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明VP1對(duì)TPL2介導(dǎo)的IRF3激活I(lǐng)FN-β信號(hào)通路有明顯抑制作用;隨后將VP1和TPL2共轉(zhuǎn)，之后轉(zhuǎn)染Poly(I∶C)，通過(guò)qRCR檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)VP1和TPL2共轉(zhuǎn)能夠抑制TPL2介導(dǎo)的下游多個(gè)干擾素刺激基因的mRNA水平。轉(zhuǎn)染不同劑量的VP1，發(fā)現(xiàn)VP1僅僅抑制TPL2的Thr290蛋白的表達(dá)。
　　本研究表明TPL2能夠通過(guò)增強(qiáng)磷酸化IRF3進(jìn)而上調(diào)IRF3激活的IFN-β信

5、號(hào)通路，同時(shí)TPL2的磷酸化位點(diǎn)Thr290是TPL2介導(dǎo)IRF3激活I(lǐng)FN-β信號(hào)通路的關(guān)鍵性位點(diǎn)。FMDV VP1可以通過(guò)抑制TPL2在Thr290位點(diǎn)發(fā)生磷酸化進(jìn)而抑制TPL2的這一生物學(xué)功能。此外，TPL2與FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白L相互作用背后潛在的分子機(jī)制尚不清楚，將是我們?nèi)蘸笱芯康姆较蚝椭攸c(diǎn)。本研究為從病毒蛋白和宿主蛋白兩個(gè)層面揭示FMDV致病機(jī)制積累了資料，為進(jìn)一步了解FMDV蛋白和宿主互作的分子機(jī)制奠定了理論