口蹄疫病毒VP1抗原基因在模式植物葉綠體中的重組和表達(dá).pdf

1、口蹄疫病毒的主要抗原組分為VP1結(jié)構(gòu)蛋白,它能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的抗體反應(yīng).最近利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的口蹄疫病毒VP1蛋白注射和飼喂小鼠后,能夠誘導(dǎo)其體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體,并使小鼠得到有效的免疫保護(hù).另外作用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)口蹄疫病毒VP1抗原蛋白具有安全廉價(jià)、蛋白折疊充分、免疫原性良好等特點(diǎn).同時(shí)植物細(xì)胞還是一種理想的口服疫苗保護(hù)載體,在其中表達(dá)的抗原蛋白甚至無須純化,可以直接口服免疫.但是抗原蛋白在植物生物反應(yīng)器中的表達(dá)量較低(占植

2、物中可溶性蛋白的0.01﹪~0.37﹪)限制了其進(jìn)一步的開發(fā)利用.由于植物葉綠體表達(dá)系統(tǒng)能夠高效表達(dá)目的基因、環(huán)境安全性高,已成為目前植物生物反應(yīng)器研究的熱點(diǎn)之一.在該文中作者將O型口蹄疫病毒VP1抗原基因分別重組和轉(zhuǎn)化到模式植物煙草和衣藻的葉綠體基因組中,并使其得到高效表達(dá),為利用植物葉綠體表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)口蹄疫基因工程疫苗提供了技術(shù)依據(jù).論文第二部分主要敘述了煙草葉綠體表達(dá)載體PTRVP1的構(gòu)建,并通過基因槍方法轉(zhuǎn)化煙草葉綠體基因組,獲

3、得了3株具有壯觀霉素抗性的轉(zhuǎn)化再生植株.經(jīng)過兩輪抗生素篩選后,采用FMDV VP1基因的一對(duì)引物和煙草葉綠體同源片段的一對(duì)引物分別對(duì)抗性植株的葉綠體DNA進(jìn)行的PCR和PCR-Southern blot分析.結(jié)果表明目的基因已經(jīng)按設(shè)計(jì)要求定點(diǎn)整合進(jìn)入煙草葉綠體基因組中,但是經(jīng)過兩輪抗生素篩選所得的轉(zhuǎn)化植株均為雜合體,要達(dá)到同質(zhì)化還需要進(jìn)一步的抗生素篩選.Western blot和ELISA免疫雜交分析證明FMDV VP1抗原蛋白在煙草葉

4、綠體中得到表達(dá),表達(dá)量占可溶性總蛋白量的2﹪~3﹪(1mg可溶性總蛋白含有20~30μg的VP1蛋白).論文第三部分主要敘述了將O型FMDV VP1與強(qiáng)黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞基(CTB)的融合基因克隆重組到衣藻葉綠體表達(dá)載體中,并采用基因槍法轉(zhuǎn)化衣藻葉綠體,獲得了具有壯觀霉素抗性的轉(zhuǎn)化子.其中挑取3個(gè)抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行三輪的抗生素同質(zhì)化篩選.并根據(jù)衣藻葉綠體同源片段chlL基因,設(shè)計(jì)一對(duì)引物對(duì)其葉綠體DNA進(jìn)行的PCR和Southern

5、blot分析.結(jié)果表明外源基因已經(jīng)定點(diǎn)整合入衣藻葉綠體基因組的chlL基因中,并且經(jīng)過三輪抗生素篩選所得的衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化子中,轉(zhuǎn)基因型葉綠體基因組拷貝占多數(shù).Western blot和ELISA免疫雜交分析表明CTBVP1融合蛋白在衣藻葉綠體中得到表達(dá),表達(dá)量占可溶性總蛋白量的3~4﹪(1mg可溶性總蛋白含有30~40μg的重組蛋白).G<,M>-ELISA結(jié)合分析證明衣藻葉綠體所表達(dá)的CTBVP1融合蛋白能夠正確地折疊,顯示出一定的生