GSK3β對Drp1磷酸化調節(jié)的機制及其功能的研究.pdf

1、線粒體的動態(tài)平衡是指線粒體處于不斷分裂和融合的穩(wěn)態(tài)中，此過程主要受分裂蛋白Drp1、Fis1及融合蛋白MFN1/2、OPA1所調控。相關的研究證實，在神經(jīng)退行性疾病尤其是阿茲海默綜合癥(AD)及亨廷頓舞蹈癥(HD)中，神經(jīng)元的動態(tài)平衡受損從而導致線粒體呈過度分裂狀態(tài)，進而影響神經(jīng)元內的ATP產(chǎn)生、凋亡信號的釋放并導致突觸功能的減退。但是，線粒體過度分裂的分子機制仍不清楚。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是神經(jīng)元中一種重要的激酶，廣泛參與

2、神經(jīng)元的發(fā)育、分化、凋亡等各個方面，對于神經(jīng)元正常功能的維持至關重要。近年的研究顯示，GSK3β活性的異常升高可能是導致AD發(fā)生的關鍵因素。而其中，GSK3β是否可以調節(jié)線粒體的動態(tài)平衡并導致疾病的發(fā)生對于AD發(fā)病機制的研究具有非常重要的價值。先前的相關研究證實，真菌中GSK3β與Drp1存在蛋白間的相互作用，提示GSK3β與Drp1的相互作用可能存在于神經(jīng)元中，并可能對神經(jīng)元功能的維持發(fā)揮重要作用。
　　為了研究GSK3β能否通

3、過Drp1來調控神經(jīng)元中線粒體的動態(tài)平衡，我們設計了一系列免疫熒光及蛋白印跡的實驗研究具體的分子機制，并建立小鼠的行為學模型觀察干預兩分子結合后對其學習與記憶能力的影響，闡明了GSK3β與Drp1的相互作用在AD發(fā)生中可能起到的作用。研究結果如下:
　　1.GSK3β活性升高促進線粒體的分裂
　　在體外培養(yǎng)7天的神經(jīng)元中，與對照組相比，過表達GSK3β會導致線粒體變短，同時含有分裂狀態(tài)線粒體的神經(jīng)元比例顯著上升;而用GSK3

4、β抑制劑AR-A014418處理會導致線粒體變長，同時含有分裂狀態(tài)線粒體的神經(jīng)元顯著下降。
　　2.Drp1參與GSK3β調控的線粒體過度分裂
　　用小干擾RNA抑制Drp1表達之后，GSK3β無法誘導線粒體的分裂，證明GSK3β調控線粒體分裂是依賴于Drp1的。并通過免疫共沉淀與免疫熒光共定位實驗進一步確定實驗結果。
　　3.Drp1上40及44位絲氨酸的磷酸化控制GSK3β調控的線粒體過度分裂
　　首先用生物

5、信息學方法預測Drp1上GSK3β磷酸化的潛在位點，并通過分子克隆技術對分值較高的位點進行點突變，模擬該位點持續(xù)磷酸化及持續(xù)去磷酸化的狀態(tài);然后用觀察線粒體形態(tài)的方法尋找實際的位點。經(jīng)過形態(tài)學的觀察，確定Drp1上40及44位的絲氨酸被GSK3β磷酸化之后，可明顯促進線粒體的分裂。
　　4.Drp1上40及44位絲氨酸通過不同的分子機制被GSK3β磷酸化
　　為了確定兩個位點磷酸化的機制，首先制備了針對兩個位點的特異性磷酸化

6、抗體并驗證其效率;隨后用特異性磷酸化抗體確定Drp1上44位絲氨酸可被GSK3β直接磷酸化，而40位絲氨酸需要44位絲氨酸先被磷酸化為基礎。
　　5.Drp1磷酸化導致其GTPase活性升高及線粒體組分分布增加
　　通過GTPase活性檢測顯示，磷酸化Drp1相比對照組Drp1的GTPase活性顯著增加;而通過提純線粒體組分后蛋白印跡發(fā)現(xiàn)磷酸化后的Drp1大部分分布于線粒體組分中，而去磷酸化的Drp1更多的分布于胞漿中;此外

7、，二聚化實驗的結果說明Drp1的磷酸化對于其二聚化的形成并沒有影響。
　　6.Drp1磷酸化會導致線粒體過度分裂并降低ATP的產(chǎn)生和樹突脊的形成
　　形態(tài)分析實驗證明Drp1磷酸化會導致線粒體過度分裂。進一步的生化和免疫熒光實驗證明Drp1磷酸化會導致細胞內ATP產(chǎn)量降低，并影響神經(jīng)元突觸的形成。
　　7.Tat-Drp1DD阻斷GSK3β與Drp1的結合并檢測其效率
　　在之前工作的基礎上，設計多肽Tat-Dr

8、p1DD干擾GSK3β與Drp1的結合，并檢測藥物處理后的Drp1磷酸化;此外，多肽處理神經(jīng)元之后可觀察到線粒體形態(tài)有一定程度的恢復。
　　8.海馬腦區(qū)注射Tat-Drp1DD可改善AD小鼠的學習與記憶能力
　　實驗選取12個月左右已顯現(xiàn)癡呆癥狀的AD小鼠為研究對象，在AD小鼠腦內注射多肽14天后，處死并取海馬腦區(qū)做蛋白印跡分析，結果顯示藥物處理后海馬腦區(qū)的Drp1磷酸化水平顯著降低。同時，小鼠腦內caspase3活性下降，

9、突觸蛋白synaptophysin表達量回升。此外，免疫組化結果顯示小鼠腦內的amyloidβ沉積明顯下降。
　　9.Tat-Drp1DD可降低AD小鼠海馬腦區(qū)的Drp1磷酸化水平
　　在行為學檢測中，實驗組用Tat-Drp1DD進行海馬腦區(qū)注射，隨后的新奇物體認知及水迷宮的行為學實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組小鼠的學習與記憶能力顯著上升。
　　結論:
　　通過分子細胞水平到動物行為學水平的一系列實驗，我們證