七氟醚對小鼠發(fā)育期神經(jīng)毒性的機(jī)制研究-GSK3β活化-Tau蛋白過度磷酸化.pdf

1、【目的】：
　　本課題主要考察多次或單次七氟醚麻醉對發(fā)育期小鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響，并探討Tau蛋白過度磷酸化及其上下游機(jī)制在其中的作用。
　　【方法】：
　　1.6日齡（P6）野生型C57BL/6小鼠，隨機(jī)分成4組：組1，（3%七氟醚+60%氧氣）2h×3天；組2，60%氧氣2h×3天；組3，（3%七氟醚+60%氧氣）2h；組4，60%氧氣2h。然后進(jìn)行分子生物學(xué)或者行為學(xué)檢測。行分子生物學(xué)檢測的幼鼠，在麻醉后即刻或2

2、天用Western-blot檢測海馬腦區(qū)Tau蛋白磷酸化水平、相關(guān)激酶和相關(guān)磷酸酯酶PP1表達(dá)的變化；進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)的幼鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，至P31開始行Morris水迷宮（MWM）檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。
　　2. P6 Tau基因敲除幼鼠隨機(jī)分成2組：組1，（3%七氟醚+60%氧氣）2h×3天；組2，60%氧氣2h×3天。接受3次七氟醚麻醉后行分子生物學(xué)或行為學(xué)檢測。用于檢測分子的小鼠在麻醉后即刻用Western-blot測定海馬

3、腦區(qū)GSK3β和P-GSK3β（Ser9），用ELISA和Western-blot測定海馬腦區(qū)IL-6的表達(dá)變化；用于行為學(xué)檢測的小鼠，麻醉后繼續(xù)正常喂養(yǎng)至P31行MWM試驗(yàn)。檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。
　　3. P6野生型C57BL/6小鼠，隨機(jī)分成4組：組1，氧氣+生理鹽水；組2，七氟醚+生理鹽水；組3，七氟醚+氯化鋰；組4，氧氣+氯化鋰。幼鼠在每次處理前30分鐘腹腔注射氯化鋰（100mg/kg）或等體積的生理鹽水，處理后行

4、分子生物學(xué)或者行為學(xué)檢測。行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的幼鼠，在麻醉后即刻用Western-blot或ELISA檢測海馬腦區(qū)相關(guān)分子表達(dá)的變化；進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)的幼鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，至P31開始行MWM檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。
　　【結(jié)果】：
　　1.3次七氟醚麻醉組野生型小鼠的遠(yuǎn)期認(rèn)知功能明顯差于對照組（吸3次氧氣），具體表現(xiàn)為：在定位航行試驗(yàn)中，七氟醚組小鼠找到平臺的潛伏期要顯著長于對照組小鼠；在空間探索試驗(yàn)中，七氟醚組小鼠穿越平臺的次

5、數(shù)也明顯少于對照組小鼠。單次七氟醚麻醉組小鼠的遠(yuǎn)期空間認(rèn)知功能與對照組沒有顯著差異。
　　2.3次七氟醚麻醉組野生型小鼠在麻醉后即刻、麻醉后2天海馬腦區(qū)Tau蛋白磷酸化（AT8）水平顯著高于對照組，而T-Tau的表達(dá)與對照組比較沒有明顯差異。單次七氟醚麻醉小鼠海馬腦區(qū)的Tau蛋白磷酸化水平在各個時(shí)間點(diǎn)與對照組比較均沒有顯著差異。
　　3.接受3次七氟醚麻醉的野生型小鼠海馬腦區(qū)Tau蛋白磷酸化相關(guān)激酶的變化情況。3次麻醉組小鼠

6、海馬腦區(qū)P-GSK3β（Ser9）的水平顯著低于對照組，而GSK3β總蛋白水平在兩組間沒有差異。其它Tau蛋白磷酸化相關(guān)的激酶JNK1/2、P-JNK1/2、ERK1/2、P-ERK1/2、CDK5、P35、P25的表達(dá)在兩組之間均沒有明顯差異。
　　4.接受3次七氟醚麻醉的野生型小鼠海馬腦區(qū)磷酸酯酶PP1的表達(dá)水平與對照組沒有明顯差異。
　　5．Tau基因純合敲除幼鼠接受3次七氟醚麻醉顯著降低其海馬腦區(qū)P-GSK3β（Se