綠茶多酚對岡田酸致大鼠海馬神經(jīng)元損傷及tau蛋白過度磷酸化的保護作用.pdf

1、目的：阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD）是一種老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是癡呆最常見的病因。目前AD的病因?qū)W和發(fā)病機制尚不清楚，也沒有特異的早期診斷AD的生物學標志及有效的治療措施，因此，AD的防治仍為世界性的醫(yī)學難題。大量研究證實Aβ纖維在大腦皮質(zhì)的堆積形成老年斑是AD病理發(fā)生早期的關鍵性事件。此外，臨床病理研究發(fā)現(xiàn)AD患者的癡呆癥狀嚴重程度與腦組織中神經(jīng)原纖維纏結（NFTs）的數(shù)量呈正相關，NTFs的主

2、要成分為過度磷酸化的tau蛋白，提示tau蛋白異常過度磷酸化與AD的發(fā)病機制直接相關。 Tau蛋白是神經(jīng)細胞主要的微管相關蛋白，對促進微管形成、穩(wěn)定微管系統(tǒng)起著重要作用。在AD患者腦中，聚集成PHF的過度磷酸化的tau蛋白（PHF-tau）明顯增加。岡田酸（okdaicacid，OA）是蛋白磷酸酯酶PP-2A與PP-1的抑制劑，在離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中能夠誘導tau蛋白過度磷酸化；同時，OA在體內(nèi)能促進Aβ沉積，造成神經(jīng)元退化，

3、突觸缺失及記憶障礙，產(chǎn)生類AD樣病理特征。綠茶多酚（greenteapolyphenols，GTPs）是從綠茶中提取出來的一種多酚類化合物，研究表明GTPs對癌癥、心血管疾病、炎性疾病及神經(jīng)變性疾病等均具有防治作用。但GTPs對AD中的tau蛋白的過度磷酸化是否具有抑制作用尚未有文獻報道。本實驗室前期研究證實GTPs能夠減輕OA誘導的大鼠海馬神經(jīng)元tau蛋白的過度磷酸化，改善大鼠記憶損傷狀況。因此，我們在前期實驗的基礎上，通過OA損傷大

4、鼠原代海馬神經(jīng)元，在離體細胞水平上進一步觀察并探討GTPs的神經(jīng)保護作用。 方法：選用出生24小時內(nèi)的SD大鼠，無菌分離并培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察，培養(yǎng)至第7天，經(jīng)冷丙酮固定后，尼氏染色鑒定神經(jīng)元。將實驗組分為6組，分別為正常對照組（normal），DMSO對照組（vehicle-control），OA損傷組（OAmodel）和GTPs保護組（OA+GTPs，GTPs濃度分別為5μg/ml，15μg/ml，25μ

5、g/ml）。將海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7天后，分別將等體積的培養(yǎng)液、含DMSO（終濃度<0.01%）的培養(yǎng)液，終濃度為10nmol/L的OA以及OA（10nmol/L）和終濃度分別為5μg/ml，15μg/ml，25μg/ml的綠茶多酚加入培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中，37℃、5%CO2孵育12小時。倒置顯微鏡下觀察OA及OA+GTPs作用于海馬神經(jīng)元后細胞的形態(tài)學變化；MTT微量比色法檢測OA及OA+GTPs對海馬神經(jīng)元的存活率影響；分光光度法檢測細胞上清

6、液中乳酸脫氫酶（LDH）含量的變化。免疫細胞化學法觀察Ser396位點的磷酸化tau蛋白的定位與表達分布情況，Westernblot方法檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)磷酸化的tau蛋白的表達并進行定量分析。 結果： 1.海馬神經(jīng)元鑒定：原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察，尼氏染色鑒定神經(jīng)元，細胞胞漿內(nèi)藍紫色顆粒及明顯的空泡狀核，為神經(jīng)元所特有，占細胞總數(shù)90%以上。細胞的數(shù)量與狀態(tài)可用于本研究。 2.細胞形態(tài)學變

7、化：正常海馬神經(jīng)元胞體呈橢圓，輪廓清晰，軸突交錯成網(wǎng)，而OA模型組（10nmol/L）的海馬神經(jīng)元明顯減少，胞體呈不規(guī)則圓形，軸突明顯退化、縮短、斷裂；GTPs處理組中，低劑量保護組（OA10nmol/L+GTPs5μg/ml）與OA沒有明顯差別，中、高劑量保護組（OA10nmol/L+GTPs15μg/ml、OA10nmol/L+GTPs25μg/ml）較OA組細胞數(shù)增多，可見軸突縮短、斷裂現(xiàn)象明顯減少，神經(jīng)元胞體之間的軸突仍可見連接

8、成網(wǎng)狀結構。 3.細胞存活率及LDH：OA10nmol/L損傷及不同濃度GTPs與OA共同孵育作用于海馬神經(jīng)元后，MTT檢測細胞存活率，上清檢測LDH含量，可見OA模型組比正常對照組及DMSO組細胞存活率明顯降低（P<0.05），LDH含量明顯增多（P<0.01）；GTPs保護組較OA模型組存活率明顯提高（P<0.05），LDH漏出明顯減少（P<0.01），以GTPs15μg/ml及25μg/ml劑量組明顯。 4.海馬神

9、經(jīng)元過度磷酸化tau蛋白的表達：免疫細胞化學結果顯示，OA模型組海馬神經(jīng)元胞體和突起的pTau-Ser396表達較正常對照組和DMSO對照組顯著增多，呈棕黃色染色，GTPs保護組的pTau-Ser396陽性表達較OA模型組明顯減少。Westernblot實驗進一步證實免疫細胞化學的結果，定量分析表明，OA模型組pTau-Ser396的表達量比正常組和DMSO對照組增加，而GTPs保護組表達量則比OA模型組降低，尤其以GTPs15μg/m