Humanin拮抗岡田酸通過誘導Tau蛋白過度磷酸化所致神經(jīng)毒的作用研究.pdf

1、本研究擬觀察HN拮抗OA通過誘導tau蛋白過度磷酸化所致的神經(jīng)毒是否具有保護作用。 實驗包括兩個部分： 第一部分、為HN拮抗OA誘導皮層神經(jīng)元毒性作用的觀察(LDH、MTT檢測和Calcein-AM染色)。 應用Calcein-AM染色進行細胞活力分析的結(jié)果顯示，OA作用后使Calcein-AM染色的陽性細胞明顯減少，即有活力的細胞明顯減少。預先應用5μM HN無明顯的保護作用，10μM HN可抑制OA引起的損傷

2、，20μM HN的保護作用明顯增強，表現(xiàn)為Calcein-AM陽性染色的細胞明顯增加，接近正常水平。 上述結(jié)果提示： 1．OA對培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，表現(xiàn)為上清液LDH升高，細胞活力降低包括MTT水平降低及Calcein-AM染色的有活力細胞減少； 2．HN可拮抗OA引起的細胞毒發(fā)揮神經(jīng)保護作用。 第二部分、Humanin拮抗岡田酸誘導皮層神經(jīng)元凋亡的作用觀察OA通過抑制PP2A而引起tau蛋白

3、過度磷酸化，除引發(fā)上述毒性作用外還可導致神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡。上述研究表明，HN可以拮抗OA誘導的神經(jīng)毒發(fā)揮保護作用，那么HN是否是通過抑制OA誘導的凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用呢?本部分實驗在證實OA誘導凋亡(采用Caspase3和TUNEL檢測)的基礎(chǔ)上，觀察HN具有的神經(jīng)保護作用。 實驗結(jié)果： 一、Caspase3活性檢測： 1．OA引起Caspase3的活性增加： 分別加入不同濃度的OA(5、10、20nM)

4、作用于培養(yǎng)細胞，隨著OA濃度的增加，其毒性作用也逐漸顯現(xiàn)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。在倒置顯微鏡下即可直接觀察到培養(yǎng)神經(jīng)元受OA作用后形態(tài)的改變，如胞體折光性下降，突起回縮明顯，甚至斷裂溶解成碎片。Caspase3檢測結(jié)果顯示，5nM OA與對照組無明顯差別，但10nM OA即可引起Caspase3活性增加到0.1420±0.01022(P<0.05)，而20nM的OA作用最強，OD值為0.1784±0.00942(P<0.01)。 2

5、．HN保護作用的觀察： 預先應用5μM的HN未能抑制OA引起的Caspase3活性增加，而10μM HN可降低OA引起的Caspase3活性增加，其OD值為0.1288±0.00512(P(0.05)，20μM HN可顯著降低OA引起的Caspase3活性增加，其OD值為0.0990±0.01079(P<0.01)。 二、TUNEL染色： TUNEL的熒光染色顯示，OA誘導凋亡的細胞核呈均勻或不均勻“圓形”或“新

6、月形”綠色熒光，未凋亡細胞核為藍色。10nM OA組培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡指數(shù)(30.95±2.27％)較對照組凋亡指數(shù)(5.75±0.65％)顯著增加，具有顯著性差異(P<0.05)。預先應用5州HN未能抑制OA引起的凋亡，10μM HN可以使凋亡指數(shù)從30.95±2.27％降低到24.84±2.20％(P<0.05)，20州HN對凋亡的保護作用更顯著，可以使凋亡指數(shù)由受損后的30.95±2.27％降低到14.71±1.32％(P<0.0