Tau蛋白過(guò)度磷酸化在大鼠脊髓損傷后大腦運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元凋亡過(guò)程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性脊髓損傷(spinal cold injury，SCI)是一種高致殘性的疾病，常導(dǎo)致SCI患者損傷平面以下肢體的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能障礙，嚴(yán)重影響患者后期的生活質(zhì)量。當(dāng)前不論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，SCI的發(fā)病率仍較高，并且總發(fā)病人數(shù)逐年上升，給患者家庭和全社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。SCI的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，包括原發(fā)性害和繼發(fā)性損害兩個(gè)階段。原發(fā)性損傷階段主要是由物理打擊直接造成脊髓組織的機(jī)械性破壞，以損傷部位為中心出血、缺血及壞

2、死等為特征;繼發(fā)性損傷是由原發(fā)性損傷序貫性激活局部和全身的炎癥反應(yīng)及損傷后的適應(yīng)性改變等引起的細(xì)胞死亡或退變。繼發(fā)性損傷在創(chuàng)傷后短時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)，并且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可以造成更多的神經(jīng)元退變或死亡，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷不亞于原發(fā)性損傷。因此，如何阻止或減輕繼發(fā)性損害對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響是SCI治療的重心和研究切入點(diǎn)。然而盡管對(duì)于SCI的治療人們做了大量的研究工作，但是目前仍然沒(méi)有取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。我們發(fā)現(xiàn)既往研究主要集中在采取措施促進(jìn)損傷部位脊髓的再生

3、，沒(méi)有過(guò)多的關(guān)注與脊髓緊密相連的大腦在SCI后有何變化，而我們此前的研究發(fā)現(xiàn)SCI后大腦部分區(qū)域出現(xiàn)了萎縮，以初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層萎縮最為明顯，并且與患者的功能恢復(fù)有密切關(guān)系;另外已經(jīng)證實(shí)SCI后大腦運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞可以出現(xiàn)凋亡。因此我們推測(cè)大腦運(yùn)動(dòng)皮層的萎縮可能對(duì)SCI患者的功能恢復(fù)產(chǎn)生阻礙作用，而凋亡可能是引起大腦運(yùn)動(dòng)皮層萎縮的重要原因。因?yàn)榧僭O(shè)位于大腦運(yùn)動(dòng)中樞的胞體已經(jīng)發(fā)生了結(jié)構(gòu)和功能改變，再生或修復(fù)的軸突不能與大腦相應(yīng)中樞形成有效的突觸連接

4、，即使脊髓斷端軸突完全再生也很難達(dá)到肢體功能完全恢復(fù)的目的。
　　既往的研究證實(shí)神經(jīng)元的凋亡有兩種方式，即caspase依賴(lài)性的凋亡途徑和caspase非依賴(lài)性途徑。其中在caspase依賴(lài)性途徑中起關(guān)鍵作用的酶是cleaved caspase-3，其被激活后使細(xì)胞最終走向凋亡;而caspase非依賴(lài)性途徑主要是由凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)介導(dǎo)。AIF是存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的一

5、種黃素蛋白，同時(shí)具有氧化還原酶活性和凋亡誘導(dǎo)活性的雙重功能，但兩種功能間是脫偶聯(lián)的。當(dāng)AIF被水解激活后可迅速進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，可以與細(xì)胞核結(jié)合使染色質(zhì)凝集、將DNA水解為小片段，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。線粒體功能障礙是引起AIF水解的重要因素。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，正常情況下與微管結(jié)合，但在被糖元合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)催化發(fā)生磷酸化后可以從微管脫落，引起微管穩(wěn)定性下降或解聚。Tau蛋

6、白磷酸化和去磷酸化之間的平衡是維持神經(jīng)元微管穩(wěn)定性、保證細(xì)胞完成線粒體等細(xì)胞器在軸漿中正常運(yùn)輸?shù)那疤?。在?chuàng)傷性腦損傷的研究中發(fā)現(xiàn)tau蛋白過(guò)度磷酸化可以引起微管解聚、線粒體分布異常和線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致了神經(jīng)元退變或凋亡。但是關(guān)于脊髓損傷后大腦運(yùn)動(dòng)皮層是否出現(xiàn)tau蛋白過(guò)度磷酸化及其與大腦運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此深入了解SCI后大腦運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元的凋亡機(jī)制，對(duì)完善SCI的病理生理機(jī)制、制定綜合治療措施具有

7、重要意義。
　　目的:
　　本研究擬通過(guò)結(jié)合不同的方法檢測(cè)不同傷程度的SCI大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞的凋亡情況、磷酸化的tau蛋白(phosphorylated tau，p-tau)及與凋亡途徑中重要的蛋白(cleaved caspase-3和AIF)的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，以明確大腦運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元的凋亡方式，并探究tau蛋白過(guò)度磷酸化在啟動(dòng)凋亡中的作用;另外早期應(yīng)用LiCl抑制tau蛋白磷酸化，觀察大腦運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞的凋亡變化和運(yùn)動(dòng)功能

8、的變化情況，最終初步闡明SCI后大腦運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元發(fā)生凋亡的機(jī)制，為SCI的治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本研究包括兩個(gè)實(shí)驗(yàn)階段:1、在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，120只平均體重為230g左右的SD(Spr ague-dawl ey)雌性大鼠隨機(jī)分為Sham組、輕度SCI組、中度SCI組和重度SCI組。Sham組只去除T8的椎板、暴露硬膜即可，不損傷脊髓;SCI組大鼠在顯露T8脊髓硬膜后，在NYU-MASCIS脊髓

9、損傷系統(tǒng)中用10g的金屬桿分別自125mm、250mm、500mm的高度自由下落打擊T8節(jié)段脊髓背側(cè)正中，即輕度SCI組、中度SCI組和重度SCI組脊髓受到打擊能量分別為125g×mm、250g×mm和500g×mm，制作不同損傷程度的SCI模型。在損傷后1d、3d、7d、14d和28d分別對(duì)大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分，再采用10％水合氯醛過(guò)量麻醉法處死大鼠，根據(jù)檢測(cè)要求的不同取大鼠的損傷段脊髓和大腦運(yùn)動(dòng)皮層（M1區(qū)）組織于不同條件下保存待測(cè)。

10、主要的檢測(cè)方法和指標(biāo)有:(1)脊髓組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，觀察造模后脊髓組織結(jié)構(gòu)的損傷情況;采用TUNEL染色觀察大腦運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞的凋亡情況，并計(jì)數(shù)TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞核，計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI);(2)Western blot檢測(cè)大腦運(yùn)動(dòng)皮層的caspase-3、AIF和tau蛋白的表達(dá)變化，采用Image Pro Plus6.0測(cè)定灰度值，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)各蛋白的

11、相對(duì)量并比較各組間的差異性;(3)采用免疫熒光染色標(biāo)記AIF和p-tau共定位情況，同時(shí)計(jì)算AIF和p tau雙標(biāo)陽(yáng)性的神經(jīng)元計(jì)數(shù)，并比較各組間的差異。(4)采用相關(guān)性分析，計(jì)算上述檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性。2、在第二階段實(shí)驗(yàn)中，30只10±2W齡、平均體重約230g的SD(Sprague-dawl ey)雌性大鼠隨機(jī)分為sham組、SCI+LiCl組和SCI+NaCl組。Sham組造模時(shí)只去除T8的椎板、暴露硬膜，不損傷脊髓;將SCI組大鼠固

12、定于NYU-MASCIS打擊器上，用250g×mm的打擊能量打擊T8節(jié)段脊髓，損傷后SCI+LiCl組大鼠立即予以20mg/kg.b.w的劑量的LiCl溶液腹腔注射，SCI+NaCl組則腹腔注射相同比例體積的生理鹽水，此后每日注射1次，連續(xù)應(yīng)用3天。觀察指標(biāo)和方法:(1)在損傷后1W時(shí)每組取6只大鼠取大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮層組織，采用TUNEL染色法觀察各組大腦運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元的凋亡情況，采用Western blot檢測(cè)p-tau和AIF的表達(dá)情

13、況;(2)在1W、2W、3W和4W對(duì)大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分，觀察后肢運(yùn)動(dòng)功能變化。
　　結(jié)果:
　　第一階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1) SCI后1d大鼠脊髓損傷段HE染色結(jié)果顯示不同損傷程度的大鼠脊髓組織的破壞程度不同，提示成功制作了不同損傷程度的大鼠模型;(2) SCI大鼠大腦皮層早期即可出現(xiàn)細(xì)胞的凋亡，并且在損傷后第7天凋亡指數(shù)達(dá)到峰值，損傷越重AI越大，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，7d的AI與28d大鼠的BBB評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r-

14、0.873，P＜0.05)，7d以后雖有減輕，但仍維持在較高水平。(3)大腦運(yùn)動(dòng)皮層p-tau與AIF的表達(dá)存在時(shí)空變化關(guān)系。大腦運(yùn)動(dòng)皮層M1區(qū)Western blot結(jié)果顯示sham組的cleaved caspase-3、AIF和p-tau在觀察期內(nèi)表達(dá)無(wú)明顯變化;Mod SCI組和Sev SCI組的cleavedcaspase-3僅在7d、14d及28d時(shí)有輕度上升，但是與Sham組和Mil SCI組相比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

15、.05);而caspase非依賴(lài)性途徑中起關(guān)鍵作用的AIF的表達(dá)在SCI后顯著上升，在7d時(shí)達(dá)到峰值，此后表達(dá)有所降低，但SCI組的AIF仍顯著高于Sham組，在相同的時(shí)間點(diǎn)損傷程度越重AIF的表達(dá)越高，組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); p-tau在SCI后早期也顯著升高，峰值的的出現(xiàn)時(shí)間與AIF一致，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)具有正相關(guān)關(guān)系(r=0.827，P＜0.01);免疫熒光的結(jié)果證實(shí)了p tau與AIF有共定位關(guān)系，

16、同時(shí)7d時(shí)的p-tau與AIF共定位陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到最大值，與28d時(shí)BBB評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系(r=-0.852，P＜0.01)。
　　第二階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)抑制tau蛋白磷酸化，可顯著降低SCI火鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞的凋亡。7d時(shí)SCI+LiCl組大腦運(yùn)動(dòng)皮層p-tau和AIF與SCI+NaCl組相比均顯著下降(P＜0.05)，并伴隨著凋亡指數(shù)的下降(P＜0.05);(2)抑制tau過(guò)度蛋白磷酸化可促進(jìn)SCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù):

17、與SCI+NaCl相比，SCI+LiCl組從2周起B(yǎng)BB評(píng)分有明顯提高，在3W和4W時(shí)兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.脊髓損傷后大腦運(yùn)動(dòng)皮層在早期便可發(fā)生細(xì)胞凋亡，與脊髓損傷程度有相關(guān)性，損傷越重引起大腦皮層凋亡的細(xì)胞越多;脊髓損傷后大腦運(yùn)動(dòng)皮層持續(xù)性的細(xì)胞凋亡可能是引起大腦運(yùn)動(dòng)皮層萎縮的重要原因。
　　2.脊髓損傷后大腦運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞的凋亡方式可能主要由AIF介導(dǎo)的非caspase依賴(lài)性

18、途徑;脊髓損傷后大腦運(yùn)動(dòng)皮層tau蛋白過(guò)度磷酸化可能在AIF的激活過(guò)程中起了重要作用。
　　3.抑制tau蛋白過(guò)度磷酸化可以減輕脊髓損傷后大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞的凋亡，并且在一定程度上促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，因此如何精確地減輕脊髓損傷后大腦運(yùn)動(dòng)皮層tau蛋白過(guò)度磷酸化可能是脊髓損傷治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，但是需要深入研究脊髓損傷后大腦運(yùn)動(dòng)皮層tau蛋白過(guò)度磷酸化在啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，以爭(zhēng)取早期、精確、有效的采取干預(yù)措施，最大限度恢復(fù)脊