結(jié)腸腺瘤樣息肉基因APC對Wnt通路β-catenin磷酸化及其核漿轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控胚胎發(fā)育和組織再生等過程中具有十分重要的作用，其異常激活與多種癌癥，尤其是結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。
　　結(jié)腸腺瘤樣息肉(Adenomatous Polyposis Coli，APC)基因是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵負(fù)向調(diào)節(jié)因子，其失活是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期分子事件。臨床研究發(fā)現(xiàn)，70-80％的散發(fā)性結(jié)直腸癌存在APC缺失或突變，產(chǎn)生截短型APC蛋白，激活Wn

2、t/β-catenin信號通路，在細(xì)胞遷移、染色體分離和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等方面具有多樣性作用。一方面，APC參與β-catenin的識別、磷酸化和靶向降解過程:另一方面，APC可能作為核穿梭蛋白，在β-catenin的核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮某些特定作用，從而降低其核水平及轉(zhuǎn)錄活性。
　　β-catenin的磷酸化是Wnt通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，降解復(fù)合體(destructioncomplex)是調(diào)節(jié)這一過程的重要因素，但其具體機(jī)制仍然存在著廣泛的爭議，

3、經(jīng)典模型認(rèn)為，APC和Axin都作為支架蛋白，確保β-catenin磷酸化的特異性，并調(diào)控Wnt信號通路。Munemitsu等認(rèn)為APC突變或缺失可導(dǎo)致β-catenin聚集，提出APC對β-catenin的磷酸化是必不可少的。此外，APC能夠進(jìn)一步增強(qiáng)Axin-GSK3復(fù)合體對磷酸化β-catenin的親和力。但也有研究提出，當(dāng)細(xì)胞中Axin水平足夠高時(shí)，APC的作用價(jià)值不大，Axin是Wnt通路的限制因素。盡管學(xué)者們對APC在Wnt

4、通路中的作用等方面進(jìn)行了大量研究，但APC的生物學(xué)功能至今仍然存在著很多未知的方面，且目前研究大多是在β-catenin穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)下進(jìn)行的，有必要建立激酶實(shí)驗(yàn)方法直接檢測內(nèi)源性β-catenin的磷酸化活性，進(jìn)一步明確APC或截短型APC在Wnt通路中對β-catenin磷酸化的調(diào)節(jié)作用，其對了解結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。
　　基于上述問題，本課題通過激酶檢測實(shí)驗(yàn)比較SW480(APC第1338個(gè)密碼子發(fā)生突變)和SW

5、480APC(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染全長APC的SW480APC細(xì)胞株，由AntonyBurgess饋贈(zèng))兩種細(xì)胞株中β-catenin的激酶活性，應(yīng)用siRNA干擾和Axin過表達(dá)等方法初步探討了APC在β-catenin磷酸化過程中的作用，利用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建APC△15(R386A)、APC△20(K345A，W383A)突變型β-catenin重組蛋白，分析APC發(fā)揮作用的具體結(jié)構(gòu)區(qū)域。并采用細(xì)胞分級等方法從亞細(xì)胞水平闡述APC對Wnt通路β-

6、catenin磷酸化調(diào)節(jié)的作用，明確其發(fā)生部位。此外，本研究還應(yīng)用熒光漂白后恢復(fù)(FRAP)技術(shù)研究β-catenin核轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)特征以及APC在其中可能發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步研究Wnt通路提供一定的依據(jù)。
　　第一部分：APC和腫瘤相關(guān)截短型APC對Wnt通路β-catenin磷酸化的調(diào)節(jié)作用
　　目的:分析SW480細(xì)胞和SW480APC細(xì)胞中Wnt通路主要相關(guān)蛋白的表達(dá)情況及β-catenin磷酸化活性，探討截短型AP

7、C和野生型APC基因產(chǎn)物在β-catenin磷酸化過程中的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1.Westernblot方法檢測SW480細(xì)胞和SW480APC細(xì)胞總提取物中APC、Axin、GSK3和CK1的表達(dá)情況。
　　2.分別以野生型β-catenin和突變型S45Dβ-catenin為底物進(jìn)行激酶實(shí)驗(yàn)，檢測磷酸化β-catenin蛋白（pSer45和pSer33/Ser37/Thr41）在SW480細(xì)胞和SW480A

8、PC細(xì)胞中的激酶活性水平。
　　3.應(yīng)用APCsiRNA干擾和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Axin技術(shù)，激酶實(shí)驗(yàn)檢測β-catenin在APC缺失或Axin過表達(dá)情況下的磷酸化活性。
　　4.利用點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建APC△15(R386A)、APC△20(K345A)和APC△20(W383A)三種突變型β-catenin重組蛋白作為底物進(jìn)行激酶實(shí)驗(yàn)，并與野生型β-catenin底物比較，檢測磷酸化β-catenin的變化情況。
　　結(jié)果:

9、
　　1.SW480和SW480APC細(xì)胞中Wnt通路組成特性:除SW480APC細(xì)胞中可見明顯的低表達(dá)量的全長APC外，其它蛋白如Axin、GSK3和CK1等的表達(dá)量基本相同。
　　2.本研究建立了直接檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞中內(nèi)源性β-catenin磷酸化活性的激酶實(shí)驗(yàn)方法。發(fā)現(xiàn)以野生型β-catenin為底物時(shí)，SW480APC細(xì)胞中兩種磷酸化β-catenin（pSer45和pSer33/Ser37/Thr41

10、）的水平顯著高于SW480細(xì)胞，其中pSer45β-catenin水平升高5倍，pSer33/Ser37/Thr41β-catenin水平升高2倍;以S45Dβ-catenin為底物進(jìn)行激酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，SW480APC細(xì)胞中pSer33/Ser37/Thr41β-catenin活性也明顯高于SW480細(xì)胞的磷酸化活性。
　　3.利用siRNA敲除APC后，兩種細(xì)胞株中β-catenin的激酶活性均顯著降低，其降低程度與全長AP

11、C缺失程度，特別是截短APC缺失程度相關(guān)。中度Axin異位表達(dá)（SW480細(xì)胞中2.3倍，SW480APC細(xì)胞中2.5倍）未能顯著刺激β-catenin磷酸化水平增高，且SW480細(xì)胞中可見Ser45β-catenin活性輕度降低。
　　4.與野生型β-catenin底物相比，以三種突變型β-catenin重組蛋白為底物進(jìn)行激酶實(shí)驗(yàn)，其β-catenin磷酸化活性均降低，并顯著見于APC△20(K345A)和APC△20(W383

12、A)β-catenin突變體，在APC△15(R386A)β-catenin突變體中的磷酸化活性減弱程度相對較輕。
　　結(jié)論:
　　1.本研究建立了直接檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞中內(nèi)源性β-catenin磷酸化活性的激酶實(shí)驗(yàn)方法。發(fā)現(xiàn)APC可直接調(diào)節(jié)Wnt通路β-catenin的磷酸化過程，并且參與CK1及GSK3介導(dǎo)的兩個(gè)磷酸化階段。
　　2.SW480細(xì)胞中截短APC片段仍能在β-catenin磷酸化過程中發(fā)揮

13、較大的作用。Axin并不是β-catenin磷酸化的限制因素，過量表達(dá)Axin并不能補(bǔ)償APC的調(diào)節(jié)作用。
　　3.證明了APC結(jié)構(gòu)中的15和20氨基酸重復(fù)序列，特別是第一個(gè)20氨基酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)在β-catenin磷酸化過程中發(fā)揮重要的作用。
　　第二部分：APC和腫瘤相關(guān)截短型APC調(diào)節(jié)β-catenin磷酸化的亞細(xì)胞定位研究
　　目的:分析SW480細(xì)胞和SW480APC細(xì)胞中Wnt通路降解復(fù)合體主要組成蛋白及β

14、-catenin磷酸化活性的亞細(xì)胞定位，進(jìn)一步探討β-catenin磷酸化的發(fā)生部位。
　　方法:
　　1.利用細(xì)胞分級方法，檢測SW480和SW480APC細(xì)胞中Wnt通路降解復(fù)合體主要組成蛋白APC、Axin、GSK3和CK1等在細(xì)胞漿(Cs)、細(xì)胞核可溶成分(Ns)和細(xì)胞核不可溶成分(Ni)、膜類成分(M)及由細(xì)胞核和細(xì)胞骨架等成分組成的致密不可溶性混合物成分(X)中的表達(dá)情況。
　　2.分別以野生型和S45D突

15、變型β-catenin為底物，對各亞細(xì)胞組分進(jìn)行激酶實(shí)驗(yàn)，WesternBlot檢測pS45和pS33/S37/T41β-catenin水平。
　　3.應(yīng)用蔗糖密度區(qū)帶離心方法進(jìn)一步分離X組分，激酶實(shí)驗(yàn)檢測不同密度區(qū)帶離心后各組分中β-catenin的磷酸化水平。WesternBlot檢測各組分中APC、Axin、GSK3、CK1α、CK1ε及相關(guān)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)志物pericentrin、γ-tubulin、Lamin、LRP等的分

16、布情況。
　　4.SW480和SW480APC細(xì)胞經(jīng)25mMLiCl培養(yǎng)20min后，加入洋地黃皂苷4℃緩慢搖10min后固定，免疫熒光分別觀察LiCl處理組細(xì)胞和對照組細(xì)胞內(nèi)APC、CK1α和pS33/S37/T41β-catenin的共定位情況。
　　結(jié)果:
　　1.兩種細(xì)胞株亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布模式基本一致。全長APC及其截短片段可見于Cs、Ni和X組分中，但主要仍集中于Cs中。Axin、CK1α和GSK3主要分布

17、于Cs和X中，而CK1ε主要分布于X組分中。
　　2.β-catenin磷酸化活性主要發(fā)生在X組分中（約占總活性的60～70％），Cs中的活性相對較弱（僅為10～20％），Ni中磷酸化β-catenin程度接近Cs水平;Ns或M組分中活性很低或未見β-catenin的磷酸化。
　　3.X組分經(jīng)蔗糖密度區(qū)帶離心后，在沉降池內(nèi)從液面到底部可分為13個(gè)不同的密度區(qū)帶(F1-F13)。激酶活性主要見于下層高密度組分中(F8～F10)

18、，WesternBlot證實(shí)其與中心體富集區(qū)域相關(guān)。
　　4.SW480APC細(xì)胞中，APC、Axin、CK1α和CK1ε主要分布于第F8～F10組分中，這與中心體定位和激酶活性發(fā)生部位一致。GSK3主要集中于低密度組分中，少量可見于底部高密度區(qū)域。而在SW480細(xì)胞中，可見CK1α高表達(dá)于F9組分，其他各蛋白則呈彌散分布。
　　5.共聚焦顯微鏡免疫熒光結(jié)果顯示:APC與CK1α共定位于細(xì)胞核周邊的胞漿中，γ-tubuli染

19、色結(jié)果表明該區(qū)域與中心體定位一致，并發(fā)現(xiàn)pS33/S37/T41β-catenin也在此處表達(dá)。應(yīng)用GSK3抑制劑LiCl處理細(xì)胞后免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了pS33/S37/T41β-catenin的中心體定位。
　　結(jié)論:
　　1.Wnt通路降解復(fù)合體主要組成蛋白(APC、Axin、GSK和CK)主要集中于Cs和X組分中，其分布與β-catenin磷酸化活性發(fā)生部位一致。
　　2.完善建立了可用于分離SW480細(xì)胞中

20、心體的方法，證實(shí)了中心體是β-catenin磷酸化活性發(fā)生的關(guān)鍵部位，β-catenin的磷酸化與以中心體相關(guān)的共沉淀復(fù)合物形成相關(guān)。
　　第三部分FRAP分析APC和腫瘤相關(guān)截短型APC對β-catenin核漿穿梭的影響
　　目的:研究β-catenin核轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)特征，探討APC對β-catenin入核和出核運(yùn)動(dòng)的影響。
　　方法:
　　1.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染YFP-β-catenin、GFP、Cherry-NLS質(zhì)

21、粒24-36h后，比較β-catenin在核內(nèi)和胞漿內(nèi)的相對穩(wěn)態(tài)分布情況。應(yīng)用FRAP技術(shù)觀察并檢測這些熒光蛋白在SW480和SW480APC細(xì)胞內(nèi)的分布和核內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況。應(yīng)用二元擴(kuò)散經(jīng)驗(yàn)方程對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合曲線分析。
　　2.比較SW480細(xì)胞和SW480APC細(xì)胞中β-catenin的核轉(zhuǎn)運(yùn)過程。應(yīng)用APCsiRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞24-36h后，比較APC敲除組細(xì)胞與對照組細(xì)胞內(nèi)YFP-β-catenin核轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)變化

22、。
　　3.SW480和SW480APC細(xì)胞轉(zhuǎn)染YFP-β-catenin24h后，應(yīng)用出核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑LMB分別預(yù)處理細(xì)胞4h和8h，F(xiàn)RAP觀察β-catenin的核轉(zhuǎn)運(yùn)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.GFP、Cherry-NLS及不同條件下的YFP-β-catenin的核/漿比例相近，（中位數(shù)～1.2）。含不同β-catenin表達(dá)水平的各個(gè)細(xì)胞間差異不影響其熒光恢復(fù)的動(dòng)力學(xué)特征。
　　2.SW480細(xì)胞的動(dòng)

23、力學(xué)特征符合二元擴(kuò)散經(jīng)驗(yàn)方程，即早期快速運(yùn)動(dòng)時(shí)相(K～0.1/sec，t1/2＜10s)和后期相對緩慢的恢復(fù)時(shí)相(遷移速率K～0.01/sec，t1/2＞1min)。其中，早期快速時(shí)相的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)與野生型全長APC或截短APC無顯著相關(guān)性。SW480細(xì)胞中β-catenin入核和出核的早期運(yùn)動(dòng)時(shí)相速度幾乎與GFP表現(xiàn)一致，但5min后達(dá)到平臺期時(shí)僅能恢復(fù)60-80％。β-catenin的核轉(zhuǎn)運(yùn)速度快于Cherry-NLS的表現(xiàn)。
　

24、　3.與SW480細(xì)胞相比，β-catenin在SW480APC細(xì)胞中的慢性恢復(fù)時(shí)相期的動(dòng)力學(xué)降低，其半衰期時(shí)間從1min到5min不等，這與全長APC導(dǎo)致β-catenin廣泛停留相關(guān)。對于β-catenin的核輸出，全長APC的表達(dá)對其并無任何影響，但截短APC能夠加速早期快速移動(dòng)時(shí)相過程。比較SW480和APC敲除后SW480細(xì)胞的核轉(zhuǎn)運(yùn)功能，發(fā)現(xiàn)APC敲除后，各階段的相對比例顯著改變，表現(xiàn)為快速時(shí)相期的增快和后期熒光恢復(fù)程度增強(qiáng)

25、。
　　4.LMB作用4h后，β-catenin的入核與出核運(yùn)動(dòng)未見明顯改變。LMB處理8h后，可見β-catenin入核運(yùn)動(dòng)顯著加快，早期移動(dòng)時(shí)相高于APC敲除細(xì)胞，幾乎與GFP的動(dòng)力學(xué)變化一致;LMB對β-catenin的出核過程無影響。
　　結(jié)論:
　　1.本研究證實(shí)了APC作為核穿梭蛋白，在β-catenin的核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中具有重要作用，可能影響腫瘤細(xì)胞中β-catenin的核內(nèi)功能，這對進(jìn)一步研究Wnt/β-c