CK1介導(dǎo)磷酸化調(diào)控OREBP低滲透壓條件下的核漿轉(zhuǎn)運(yùn).pdf

1、滲透壓反應(yīng)增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(Osmolarity Response EnhancerBinding Protein，OREBP或稱Tonicity Enhancer Binding Protein，TonEBP)，又名：活化T淋巴細(xì)胞核因子5(Nuclear Factor of ActivatedT Cell 5，NFAT5)是迄今為止唯一已知的哺乳動(dòng)物細(xì)胞滲透壓反應(yīng)調(diào)節(jié)因子。當(dāng)細(xì)胞外微環(huán)境滲透壓升高時(shí)，OREBP作為滲透壓相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

2、，從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到一系列滲透壓相關(guān)靶基因上游的滲透壓反應(yīng)增強(qiáng)子區(qū)域(Osmolarity Response Enhancer，ORE)，啟動(dòng)它們的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)滲透性溶質(zhì)濃度，從而降低胞內(nèi)離子濃度，維持細(xì)胞正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞外滲透壓降低，OREBP從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平隨之降低。生理情況下，腎臟髓質(zhì)，軟骨及消化道上皮等組織器官所處環(huán)境的滲透壓波動(dòng)極大，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，滲透壓反應(yīng)機(jī)制是維持這些組織器官正常生理功

3、能的最重要防御機(jī)制。 近來(lái)，細(xì)胞核、漿之間的運(yùn)動(dòng)己成為OREBP功能研究的熱點(diǎn)，其具體機(jī)制有一定的發(fā)現(xiàn)，但是仍然不夠詳盡。本課題組于2006年發(fā)現(xiàn)了三個(gè)控制OREBP核漿轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)域：NLS(Nuclear LocalizationSignal)，NES(Nuclear Expo～Signal)和AED(Auxiliary Export Domain，AED)，NLS負(fù)責(zé)OREBP高滲、等滲下入細(xì)胞核，NES通過(guò)與CRM1(N

4、uclear Export Receptor Exportin 1)作用負(fù)責(zé)其等滲、低滲下出細(xì)胞核，而AED(132-156aa)可在低滲條件下，獨(dú)自攜帶OREBP出細(xì)胞核，這一過(guò)程不依賴于NES，那么AED是通過(guò)什么機(jī)制介導(dǎo)OREBP出胞核的呢?最近的研究發(fā)現(xiàn)：磷酸化修飾能影響蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象及其與核漿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互作用，從而影響該蛋白的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。低滲刺激是否通過(guò)磷酸化AED區(qū)域的某些氨基酸殘基，改變OREBP的構(gòu)象，促使其出細(xì)胞

5、核?本課題圍繞這一問(wèn)題展開(kāi)了相關(guān)研究。 1.使用丙氨酸點(diǎn)突變篩查方法，將AED區(qū)域9個(gè)候選氨基酸逐個(gè)突變成惰性丙氨酸，觀察突變后FLAG-OREBP1-581Δ1-131融合蛋白在低滲刺激下的亞細(xì)胞定位。我們發(fā)現(xiàn)：野生型融合蛋白：胞核型細(xì)胞占9％，胞漿型細(xì)胞占79％；S155A突變具有明顯抑制低滲出核效果，胞核型細(xì)胞占66％，胞漿型細(xì)胞占16.7％，提示：S155位點(diǎn)在低滲出胞核過(guò)程中有重要作用。 2.低滲處理后，對(duì)

6、FLAG-OREBP1-581進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，S155及S158兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾。將這兩個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)楸彼峄蛘咛扉T冬氨酸的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LAG-OREBP1-581Δ1-131S155A、S158A及S155/158A突變?nèi)诤系鞍拙荒茉诘蜐B下出胞核，S155D突變?nèi)诤系鞍啄茼樌霭?，而S158D及S155/158D兩個(gè)突變?nèi)诤系鞍椎蜐B出胞核受抑。同時(shí)我們構(gòu)建GFP-OREBP1-581融合蛋白及各個(gè)突變體，使用激光共聚焦顯微鏡

7、實(shí)時(shí)觀察低滲刺激下的GFP融合蛋白出胞核進(jìn)程，結(jié)果與細(xì)胞免疫化學(xué)分析一致。因此我們認(rèn)為：只有S155和S158按先后順序依次發(fā)生磷酸化修飾，OREBP才能在低滲刺激下順利出胞核。 3.使用GST-OREBP146-167融合蛋白及各個(gè)突變體作為底物，進(jìn)行體外激酶活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)有未知激酶在低滲刺激下迅速激活，S158位點(diǎn)磷酸化以S155位點(diǎn)磷酸化為前提，在體內(nèi)使用FLAG-OREBP1-581△1-131及各個(gè)突變體，通

8、過(guò)凝膠電泳滯后實(shí)驗(yàn)證實(shí)了體外激酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。另一方面，根據(jù)生物信息學(xué)分析提示信息，采用重組人CK1α1，證實(shí)當(dāng)S155磷酸化后，S158位點(diǎn)成為了CK1的作用靶點(diǎn)，CK1-7抑制低滲刺激胞核提取物內(nèi)CK1活性后，GST-OREBP146-167S155D的磷酸化修飾明顯受抑制；使用siRNA抑制體內(nèi)CK1各亞型表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CK1α1L在OREBP低滲刺激下的出胞核過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)使用CK1α1L shRNA進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)