CK1介導磷酸化調控OREBP低滲透壓條件下的核漿轉運.pdf

1、滲透壓反應增強子結合蛋白(Osmolarity Response EnhancerBinding Protein，OREBP或稱Tonicity Enhancer Binding Protein，TonEBP)，又名：活化T淋巴細胞核因子5(Nuclear Factor of ActivatedT Cell 5，NFAT5)是迄今為止唯一已知的哺乳動物細胞滲透壓反應調節(jié)因子。當細胞外微環(huán)境滲透壓升高時，OREBP作為滲透壓相關的轉錄因子

2、，從細胞漿進入細胞核，結合到一系列滲透壓相關靶基因上游的滲透壓反應增強子區(qū)域(Osmolarity Response Enhancer，ORE)，啟動它們的表達，提高細胞內(nèi)相應滲透性溶質濃度，從而降低胞內(nèi)離子濃度，維持細胞正常生理功能。當細胞外滲透壓降低，OREBP從胞核轉運到胞漿，相關基因的轉錄水平隨之降低。生理情況下，腎臟髓質，軟骨及消化道上皮等組織器官所處環(huán)境的滲透壓波動極大，持續(xù)時間長，滲透壓反應機制是維持這些組織器官正常生理功

3、能的最重要防御機制。 近來，細胞核、漿之間的運動己成為OREBP功能研究的熱點，其具體機制有一定的發(fā)現(xiàn)，但是仍然不夠詳盡。本課題組于2006年發(fā)現(xiàn)了三個控制OREBP核漿轉運的結構域：NLS(Nuclear LocalizationSignal)，NES(Nuclear Expo～Signal)和AED(Auxiliary Export Domain，AED)，NLS負責OREBP高滲、等滲下入細胞核，NES通過與CRM1(N

4、uclear Export Receptor Exportin 1)作用負責其等滲、低滲下出細胞核，而AED(132-156aa)可在低滲條件下，獨自攜帶OREBP出細胞核，這一過程不依賴于NES，那么AED是通過什么機制介導OREBP出胞核的呢?最近的研究發(fā)現(xiàn)：磷酸化修飾能影響蛋白質的分子構象及其與核漿轉運蛋白的相互作用，從而影響該蛋白的核漿轉運過程。低滲刺激是否通過磷酸化AED區(qū)域的某些氨基酸殘基，改變OREBP的構象，促使其出細胞

5、核?本課題圍繞這一問題展開了相關研究。 1.使用丙氨酸點突變篩查方法，將AED區(qū)域9個候選氨基酸逐個突變成惰性丙氨酸，觀察突變后FLAG-OREBP1-581Δ1-131融合蛋白在低滲刺激下的亞細胞定位。我們發(fā)現(xiàn)：野生型融合蛋白：胞核型細胞占9％，胞漿型細胞占79％；S155A突變具有明顯抑制低滲出核效果，胞核型細胞占66％，胞漿型細胞占16.7％，提示：S155位點在低滲出胞核過程中有重要作用。 2.低滲處理后，對

6、FLAG-OREBP1-581進行質譜檢測發(fā)現(xiàn)，S155及S158兩個位點發(fā)生磷酸化修飾。將這兩個位點突變?yōu)楸彼峄蛘咛扉T冬氨酸的實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LAG-OREBP1-581Δ1-131S155A、S158A及S155/158A突變?nèi)诤系鞍拙荒茉诘蜐B下出胞核，S155D突變?nèi)诤系鞍啄茼樌霭耍鳶158D及S155/158D兩個突變?nèi)诤系鞍椎蜐B出胞核受抑。同時我們構建GFP-OREBP1-581融合蛋白及各個突變體，使用激光共聚焦顯微鏡

7、實時觀察低滲刺激下的GFP融合蛋白出胞核進程，結果與細胞免疫化學分析一致。因此我們認為：只有S155和S158按先后順序依次發(fā)生磷酸化修飾，OREBP才能在低滲刺激下順利出胞核。 3.使用GST-OREBP146-167融合蛋白及各個突變體作為底物，進行體外激酶活性實驗，發(fā)現(xiàn)細胞核內(nèi)有未知激酶在低滲刺激下迅速激活，S158位點磷酸化以S155位點磷酸化為前提，在體內(nèi)使用FLAG-OREBP1-581△1-131及各個突變體，通

8、過凝膠電泳滯后實驗證實了體外激酶實驗的結果。另一方面，根據(jù)生物信息學分析提示信息，采用重組人CK1α1，證實當S155磷酸化后，S158位點成為了CK1的作用靶點，CK1-7抑制低滲刺激胞核提取物內(nèi)CK1活性后，GST-OREBP146-167S155D的磷酸化修飾明顯受抑制；使用siRNA抑制體內(nèi)CK1各亞型表達，發(fā)現(xiàn)CK1α1L在OREBP低滲刺激下的出胞核過程中發(fā)揮重要作用，同時使用CK1α1L shRNA進一步證實實驗結果。通過