CK1α激酶通過磷酸化蛋白RIP影響TNF-NF-κB信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo).pdf

1、CK1α是caseinkinase1(酪蛋白激酶1)家族的一個成員，對Wnt、Hedgehog、TGFβ、NF-AT等細胞信號通路有重要的調(diào)節(jié)作用。文獻提示CK1α也參與TNFα的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但其確切作用機制目前并不清楚。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化和細胞凋亡是引起TNFα細胞效應(yīng)的主要機制，據(jù)此，研究了CK1α對這兩方面的影響。 在應(yīng)用熒光素酶報告基因檢測NF-κB活性的實驗中，發(fā)現(xiàn)野生型CK1α能增強TNFα對NF-κB報告基因

2、的激活作用，而其激酶失活突變體CK1α(K46A)則能抑制該效應(yīng)達到50％。用CK1激酶抑制劑IC261抑制內(nèi)源性的CK1活性，或者用CK1α-siRNA減除內(nèi)源性CK1α蛋白的表達，都觀察到TNFα對NF-κB報告基因的激活作用受到抑制，說明CK1α確實對NF-κB的通路有影響。 為排除CK1α對NF-κB通路的作用是一種非特異性的影響，選取了該通路中的一些關(guān)鍵成員與CK1α進行了免疫共沉淀研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK1α可與TNF

3、R1(胞內(nèi)區(qū))、RIP、TRAF6和IKKα免疫共沉淀，而與TRADD，TRAF2，IKKβ和IKKγ未能共沉淀。而且功能研究顯示，CK1α能增加TNFR1(胞內(nèi)區(qū))、TRAF2、RIP、TRADD和IKKα對NF-κB的激活作用，而CK1α(K46A)則抑制NF-κB的活性，表明CK1α是TNFα信號通路中一個新的成員。 從上述結(jié)果中注意到，CK1α與RIP(receptor-interactingprotein)的結(jié)合效應(yīng)

4、和功能協(xié)同最為明顯，提示兩者存在直接的聯(lián)系。為此，我們重點研究了CK1α對RIP的影響。根據(jù)RIP的功能結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了RIP的截斷突變體，分別包含RIP的激酶結(jié)構(gòu)域、死亡結(jié)構(gòu)域以及兩者之間的中間區(qū)，結(jié)合實驗顯示：CK1α與RIP的激酶結(jié)構(gòu)域和中間區(qū)都可以結(jié)合，而與死亡結(jié)構(gòu)域不結(jié)合。體外磷酸化實驗和應(yīng)用特異的抗磷酸化絲/蘇氨酸抗體的免疫印跡檢測都都顯示CK1α可以磷酸化RIP。RIP的激酶失活突變體RIP(K45A)與CK1α共轉(zhuǎn)染時

5、，其蛋白表達能夠觀察到一條磷酸化的電泳延遲帶，因為排除了RIP的自身磷酸化，延遲帶的出現(xiàn)意味著CK1α修飾的結(jié)果。用RIP不同結(jié)構(gòu)域構(gòu)造的GST融合蛋白為底物，進行的體外磷酸化實驗表明，RIP的中間區(qū)是CK1α磷酸化的主要區(qū)段。 TNFα能夠同時激活NF-κB和細胞凋亡兩種相反的效應(yīng)，細胞的最終命運取決于兩種效應(yīng)的平衡狀況。RIP是調(diào)節(jié)兩種效應(yīng)平衡的關(guān)鍵分子，細胞凋亡發(fā)生時，caspase8被激活，后者切割RIP，引起NF-κ

6、B通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)阻滯，而RIP被切割后產(chǎn)生的C末端片段，RIPc，卻能夠增加細胞凋亡復(fù)合物的形成，兩種結(jié)果共同促進了凋亡的發(fā)生。既然CK1α影響NF-κB活性，又影響RIP功能，進一步觀察了CK1α對TNFα引起細胞凋亡的影響。單獨TNFα不會誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，放線菌酮CHX和TNFα的共同作用才能使Hela細胞發(fā)生凋亡。我們用IC261處理Hela細胞，抑制其CK1激酶活性，在TNFα與CHX的誘導(dǎo)下，能顯著增加細胞凋亡的發(fā)生；而經(jīng)過