促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子通過(guò)對(duì)GSK3β的磷酸化促進(jìn)U87MG細(xì)胞的凋亡.pdf

1、背景：膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的腫瘤，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，易侵犯重要的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，預(yù)后差，復(fù)發(fā)率及死亡率高。雖然外科手術(shù)和放化療治療效果都有了極大的提高，但是還遠(yuǎn)未達(dá)到理想的效果。能否通過(guò)生物治療（靶向治療）延長(zhǎng)患者生存期，這給我們提供了一個(gè)全新的思路。
　　研究表明，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平并激活cAMP依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)倒途徑能夠促進(jìn)中樞及外周各種神經(jīng)組織的存活。在CRF作用于小腦顆粒細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)CRF-CRFR-cAMP-PKA激活

2、，最終導(dǎo)致GSK-3β的磷酸化在神經(jīng)保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用[1]。GSK3β的生物學(xué)功能較復(fù)雜，在腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移及凋亡、癌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、加速細(xì)胞周期過(guò)程中起到調(diào)控作用。GSK3β在不同遺傳背景的細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用，所以必須明確特定細(xì)胞中GSK3β激活與失活所發(fā)揮的作用才能進(jìn)一步加以利用。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) CRF能促進(jìn)膠質(zhì)瘤 U87MG凋亡，且凋亡相關(guān)蛋白capase-3的表達(dá)與細(xì)胞凋亡趨勢(shì)一致，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) CRF作用于 U87

3、細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)cAMP及PKA水平明顯升高。CRF作用于兩種細(xì)胞后上游信號(hào)分子的表達(dá)趨勢(shì)一致，但是結(jié)果卻完全相反，所以有必要進(jìn)一步研究CRF作用下U87MG內(nèi)GSK3β的活性狀態(tài)及對(duì)細(xì)胞凋亡所起的作用。
　　目的：研究CRF作用于人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞后pGSK3β在細(xì)胞漿和細(xì)胞核的表達(dá)情況，探討pGSK3β在CRF促進(jìn)U87MG細(xì)胞凋亡中所起作用。
　　方法：
　　1.免疫熒光顯微鏡檢測(cè)正常U87細(xì)胞和CRF作用后的

4、細(xì)胞內(nèi)pGSK3β是否有表達(dá)。
　　2.培養(yǎng)U87細(xì)胞，用不同濃度CRF（10-7，10-8，10-9 mol/L）進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時(shí)間分為12h，24h，36h，每個(gè)濃度和時(shí)間點(diǎn)都設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組。然后應(yīng)用胞漿/胞核蛋白提取試劑盒分開(kāi)提取胞漿和胞核蛋白，用western blot檢測(cè)細(xì)胞漿及細(xì)胞核pGSK3β的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.免疫熒光顯微鏡顯示：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都有pGSK-3β的表達(dá)。
　　2.W

5、estern blot檢測(cè)細(xì)胞漿與細(xì)胞核pGSK-3β的結(jié)果顯示：CRF10-7 mol/L組:12h，24h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿和細(xì)胞核pGSK-3β的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差別（胞漿 Z12h=-1.091， P=0.1375， Z24h=-0.218， P=0.4135，胞核Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-0.655，P=0.2565）。36h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿和細(xì)胞核pGSK-3β的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（胞漿Z36h=-1

6、.964，P=0.025，胞核Z36h=-1.964，P=0.025）。CRF10-8 mol/L組:12h，24h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿和細(xì)胞核 pGSK-3β的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差別（胞漿 Z12h=-1.107， P=0.134，Z24h=-1.528，P=0.0635，胞核Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-1.091， P=0.1375）。36h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿和細(xì)胞核pGSK-3β的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（胞漿Z36h=

7、-1.964，P=0.025，胞核Z36h=-1.964，P=0.025）。CRF10-9 mol/L組:12h，24h，36h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿和細(xì)胞核pGSK-3β的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差別（胞漿Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-0.218，P=0.4135，Z36h=-0.218， P=0.4135，胞核Z12h=-0.218，P=0.2135，Z24h=-1.091，P=0.1375，Z36h=-1.091， P=

8、0.1375）。
　　3.36h實(shí)驗(yàn)組胞漿和胞核pGSK-3β/36h對(duì)照組胞漿和胞核pGSK-3β的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：CRF10-7 mol/L, CRF10-8 mol/L, CRF10-9 mol/L三組之間存在明顯差別（胞漿 Chi-square實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組=7.200， P=0.027，胞核Chi-square實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組=7.200，P=0.027）。
　　結(jié)論：
　　1.免疫熒光顯微鏡顯示：U87MG細(xì)胞