烏頭堿調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化微環(huán)境降低肺癌惡性的研究.pdf

1、肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類健康。臨床治療肺癌的方法有放射治療、化學(xué)治療、介入治療、基因治療等，但肺癌患者的預(yù)后仍然很差，中晚期患者5年生存率僅為15％。與腫瘤發(fā)病后治療相比，腫瘤預(yù)防無疑是降低腫瘤死亡率最好的辦法。之前腫瘤的治療主要是放在腫瘤自身，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境對腫瘤發(fā)生發(fā)展同樣至關(guān)重要，腫瘤微環(huán)境為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供物質(zhì)和能量。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生過程中的一個重要特征，其同樣受腫瘤微環(huán)

2、境的調(diào)控。烏頭堿具有強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用，臨床上廣泛用于關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)寒濕痹、坐骨神經(jīng)痛等，其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)大且不容易耐受。近年來，烏頭堿在腫瘤治療方面的報道也越來越多，一般認(rèn)為烏頭堿通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或者增強(qiáng)放化療效果作用于腫瘤，而在預(yù)防與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境方面少有報道。本研究的目的是觀察細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化對烏頭堿降低肺癌惡性的貢獻(xiàn)，以期為肺癌防治提供新思路。
　　本研究首先對烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌模型進(jìn)行優(yōu)化，通過比

3、較肺癌發(fā)生率、穩(wěn)定性和平均腫瘤個數(shù)，評價造模3次和10次對小鼠肺癌發(fā)生率的影響，并比較昆明小鼠、BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠三種品系對烏拉坦誘導(dǎo)肺癌的敏感性；免疫組化法檢測小鼠肺組織TTF-1，酶聯(lián)免疫試劑盒法檢測小鼠血漿中CEA含量，確定小鼠肺癌發(fā)生。接著觀察烏頭堿對烏拉坦小鼠肺癌的影響，比較小鼠體重、自主活動、肺臟指數(shù)和腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，免疫熒光法檢測小鼠肺組織上皮間充質(zhì)相關(guān)蛋白以及小鼠肺組織中干性標(biāo)志蛋白的表達(dá)。為了觀察烏頭堿對

4、肺癌細(xì)胞的影響，我們用MTT法篩選出對LLC細(xì)胞10%抑制率的烏頭堿濃度，用其處理LLC細(xì)胞，兩周后，PCNA免疫熒光法檢測LLC細(xì)胞的惡性增殖能力，Transwell檢測侵襲能力，細(xì)胞劃痕檢測遷移能力，軟瓊脂克隆法、細(xì)胞成球法檢測LLC細(xì)胞自我更新能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Oct-4、NANOG、PCNA的表達(dá)量，Western blot檢測細(xì)胞中上皮間充質(zhì)相關(guān)蛋白和EGF、FGF、HGF、OSM的表達(dá)；并在加入烏頭堿處理的

5、細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入EGF、FGF、HGF、OSM抗體，觀察其對烏頭堿對LLC細(xì)胞惡性作用的影響。最后，我們改變肺癌細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子水平，加入EGF、FGF、HGF、OSM模擬烏頭堿調(diào)控LLC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的微環(huán)境，觀察其與烏頭堿是否有相似作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射烏拉坦600mg/Kg，每周1次，造模10次能夠建立發(fā)生率達(dá)到100%、死亡率低的小鼠肺癌模型，昆明小鼠是最敏感造模小鼠。在小鼠肺癌發(fā)生過程中，肺組織T

6、TF-1表達(dá)增加，血漿中CEA含量增加。烏頭堿治療烏拉坦小鼠肺癌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烏頭堿能夠增加肺癌小鼠體重和自主活動，降低肺癌小鼠肺臟指數(shù)，減少肺癌小鼠肺部結(jié)節(jié)數(shù)，增加肺癌小鼠E-Cadherin和Cytokeratin18，降低N-Cadherin和Vimentin，降低Oct-4、NANOG、PCNA的表達(dá)量，降低肺癌細(xì)胞的惡性。烏頭堿處理LLC細(xì)胞結(jié)果顯示，烏頭堿在不影響LLC細(xì)胞正常增殖的情況下，能夠降低LLC細(xì)胞的惡性增殖、侵襲

7、、遷移能力，減少軟瓊脂克隆數(shù)和細(xì)胞成球數(shù)，降低Oct-4、NANOG、PCNA表達(dá)，增加E-Cadherin和Cytokeratin18，降低N-Cadherin和Vimentin，降低LLC細(xì)胞惡性，并且增加LLC細(xì)胞中EGF、FGF、HGF、OSM表達(dá)；而加入EGF、FGF、HGF、OSM中任意一種細(xì)胞因子抗體，都會提高LLC細(xì)胞的惡性增殖和侵襲能力，上調(diào)肺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)過程，增加干性相關(guān)蛋白的表達(dá)，明顯減弱烏頭堿降低LLC細(xì)胞惡

8、性的作用。最后我們發(fā)現(xiàn)，在LLC細(xì)胞培養(yǎng)基中加入EGF、FGF、HGF、OSM四種細(xì)胞因子能夠改變LLC細(xì)胞形態(tài)，降低LLC細(xì)胞的惡性增殖、侵襲、遷移能力，減少軟瓊脂克隆數(shù)和細(xì)胞成球數(shù)，增加E-Cadherin和Cytokeratin18，降低N-Cadherin和Vimentin，降低Oct-4、NANOG、PCNA表達(dá)量，能夠起到和烏頭堿相似的作用。
　　綜上所述，腹腔注射烏拉坦600mg/Kg，每周1次，造模10次是小鼠肺癌