MiR-541調控納米SiO2致大鼠肺纖維化中上皮-間充質轉化(EMT)的作用機制研究.pdf

1、納米二氧化硅(silicon dioxide，SiO2)由于其獨特的理化性質被廣泛應用于涂料、化妝品、催化劑、建筑材料、生物醫(yī)學等多個領域，人群職業(yè)暴露的機會不斷增加，其生物安全性仍不明確。近年來動物實驗表明，納米SiO2短期暴露可引起嚴重的肺部炎癥乃至動物死亡，長期暴露則可致肺纖維化。因其纖維化的機制尚不完全清楚，且人群多為低劑量長期暴露，是否可引起肺纖維化尚未有足夠的證據，所以揭示納米SiO2致肺纖維化發(fā)生的分子機制可以其慢性、亞慢

2、性毒性評價提供科學依據，也可其致肺纖維化作用提供早期敏感標志物及有效作用靶點。
　　肺纖維化是一類由多種病因引起的肺組織損傷、肺泡結構破壞、成纖維細胞聚集、細胞外基質沉積及肺組織結構異常重塑的不可逆性疾病。肺泡Ⅱ上皮細胞可通過上皮-間充質轉化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)轉變?yōu)槌煞纬衫w維細胞/肌成纖維細胞，是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要細胞生物學事件。游離SiO2、博來霉素、百草枯、放射性物

3、質所致肺纖維化及特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)均被證實與EMT相關，納米SiO2致肺纖維化的過程也可能發(fā)生EMT。EMT的發(fā)生與多種細胞生長因子如轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor beta，TGF-β)、纖維母細胞生長因子(Fibroblast GrowthFactor，F(xiàn)GF)、胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Fact

4、or，IGF)、結締組織生長因子(Connective TissueGrowth Factor，CTGF)等密切相關，TGF-β被認為是EMT最關鍵的誘導因子。TGF-βⅢ型受體(TGF-βreceptor typeⅢ，TGF-β RⅢ)是TGF-β通路的輔助受體，與TGF-β有很高的親和力，其功能是通過與TGF-β結合后將TGF-β傳遞給TGF-β RⅠ和TGF-β RⅡ從而增強TGF-β信號通路。纖維母細胞生長因子7(Fibrobl

5、ast Growth Factor7，F(xiàn)GF7)是FGF家族中重要的一員，在急性肺損傷中具有促進肺泡上皮細胞增生、分化的作用。TGF-β RⅢ及FGF7的過表達與肺纖維化中EMT的發(fā)生有關。微小RNA(microRNAs，miRNAs)作為重要的轉錄后調控因子近年來被證實與多種肺纖維化疾病密切相關，miRNAs是EMT主要的調控因子，在EMT發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本課題組前期的研究表明，納米SiO2經氣管一次性灌注后可致大鼠肺損傷，染塵

6、7d、15d、30d主要表現(xiàn)為間質性肺炎，染塵60d、90d主要表現(xiàn)為肺間質纖維化;高通量測序結果表明miR-541是納米SiO2染塵60d、90d大鼠肺組織中表達下調的miRNA，推測miR-541可能通過調控EMT在納米SiO2致大鼠肺間質纖維化中發(fā)揮作用。為闡明miR-541在納米SiO2致大鼠肺纖維化中的生物學作用及明確miR-541與TGF-β信號通路、EMT關系，本研究將從整體動物和體外細胞兩個水平來探討其分子機制，實驗結果

7、如下:
　　1.用TargetScan數據庫對miR-541進行靶基因預測，結果顯示預測靶基因共83個。用GO和KEGG數據庫對83個預測靶基因進行基因富集和信號通路分析發(fā)現(xiàn)，miR-541在TGF-β受體信號通路和細胞分化的調控比較顯著。根據本課題組前期的病理結果及上述生物信息學分析結果，本研究將TGF-β RⅢ、FGF7確定為miR-541重要的預測靶基因;miR-541可通過調控TGF-β受體信號通路和FGF通路在肺泡上皮細

8、胞的分化過程中發(fā)揮作用。
　　2.RT-qPCR結果顯示，在納米SiO2染塵7d、15d、30d、60d、90d大鼠肺組織中miR-541及E-cad mRNA的表達水平與對照組比較均顯著下調(差異倍數≤-2)，隨染塵時間延長呈下調趨勢(P＜0.05），60d、90d分別較7d、15d、30d顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); FGF7 mRNA在各染塵時間點的表達與對照組比較均顯著上調(P＜0.05），TGF-β1、T

9、GF-β RⅢ和COLⅢ mRNA在60d、90d顯著上調(P＜0.05）;α-SMA mRNA在染塵30d、60d、90d顯著上調(P＜0.05); TGF-β RⅢ、FGF7、TGF-β1、α-SMA、COLⅢmRNA的表達水平隨染塵時間變化均呈上調趨勢（P＜0.05），60d、90d分別較7d、15d、30d顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。Western Blot結果表明，E-cad蛋白的表達水平在染塵60d、90d與

10、對照組比較顯著下調(P＜0，05)，隨染塵時間延長呈下調趨勢(P＜0.05)，60d、90d分別較7d、15d、30d顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); TGF-β RⅢ、FGF7、TGF-β1、α-SMA、COLⅢ蛋白的表達水平在染塵30d、60d、90d與對照組比較均顯著上調（P＜0.05），60d、90d分別較7d、15d、30d顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　雙熒光素酶報告基因試驗結果顯示，將T

11、GF-β RⅢ、FGF73'UTR野生型的雙熒光素酶報告載體分別與miR-541 mimic、mimic NC共轉染A549細胞后，熒光素酶活性水平與mimic NC組比較顯著降低，報告相對熒光值分別為（65±9）％、（35±4）％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;將位點突變后的雙熒光素酶報告載體再分別與miR-541 mimic、mimic NC共轉染A549細胞后，報告相對熒光值分別為（99±14）％、(90±3)％，與mimic

12、 NC組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。上述結果提示TGF-β RⅢ和FGF7是miR-541的靶基因，miR-541通過直接靶向調控TGF-β RⅢ和FGF7從而發(fā)揮其生物學作用。
　　3.用5ng/ml的TGF-β1誘導48h后，可觀察到A549細胞由上皮樣向成纖維細胞樣轉變，RT-qPCR及Western Blot結果表明，與對照組比較，miR-541，E-cad mRNA及其蛋白質表達水平均顯著下調(差異倍數≤-2

13、)，α-SMA、COLⅢ、TGF-β RⅢ、FGF7 mRNA及其蛋白質表達水平均顯著上調(P＜0.05);采用受體阻斷劑(receptor blocker，RB)誘導3h后再經TGF-β1誘導48h后未觀察到A549細胞的形態(tài)學發(fā)生改變，RT-qPCR及Western Blot結果表明，E-cad、α-SMA、COLⅢ mRNA及其蛋白的表達水平無明顯變化，miR-541、TGF-β RⅢ、FGF7 mRNA的表達亦無明顯改變(P＞0

14、.05)。miR-541mimic、mimic NC、miR-541inhibitor和inhibitor NC分別轉染A549細胞24h再經5ng/ml TGF-β1誘導48h后，與對照組比較，細胞的增殖率分別為（115±7）％、（106±3）％、（97±8）％、（103±3）％，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），鏡下均未觀察到A549細胞的形態(tài)學發(fā)生改變;但RT-qPCR及Western Blot結果表明miR-541 inhib

15、itor轉染組A549細胞中miR-541、E-cad mRNA與蛋白表達均顯著下調，α-SMA、COLⅢ、TGF-β RⅢ及FGF7 mRNA與蛋白質的表達水平均顯著上調(P＜0.05)。miR-541 mimic轉染組A549細胞中miR-541顯著上調，TGF-βRⅢ mRNA、FGF7 mRNA及其蛋白質表達水平均下調，E-cad、α-SMA和COLⅢ mRNA及蛋白質的表達水平均無明顯變化;mimic NC轉染組和inhibi

16、tor轉染組A549細胞中miR-541，TGF-β RⅢ、FGF7、E-cad、α-SMA和COLⅢ mRNA及蛋白質表達水平均無明顯變化(P＞0.05)。結果表明TGF-β1可抑制miR-541的表達從而促進EMT的發(fā)生，過表達的miR-541有減弱TGF-β及FGF通路的作用，進而抑制EMT的發(fā)生。
　　綜上所述，納米SiO2致大鼠肺纖維化的過程中發(fā)生了EMT，TGF-β RⅢ和FGF7是miR-541的靶基因。miR-54