骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對博萊霉素致大鼠肺纖維化治療的研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分:SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　1.目的:
　　本實驗擬通過分離、培養(yǎng)、純化SD大鼠BMSCs，誘導(dǎo)其向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，并對其細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行初步鑒定，希望建立一種理想的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增體系，為組織工程尋找良好的種子細(xì)胞提供實踐基礎(chǔ)。
　　2.方法:
　　2.1BMSCs的分離、培養(yǎng):取6-8周齡SD大鼠10只，清潔級，大鼠腹

2、腔注射2％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，75％酒精浸泡10分鐘。無菌條件下取下脛骨及股骨，PBS液洗3次。剪去脛骨和股骨的干骺端，暴露骨髓腔，用無菌PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔;將沖出的骨髓制成單細(xì)胞懸液，1200rpm離心5分鐘，棄去上清，重懸，以3-4×105個細(xì)胞/cm2接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，然后置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.2BMSCs的培養(yǎng)、純化及傳代:
　　2.3BMSCs形態(tài)學(xué)觀察:倒置相差顯微鏡每日觀察

3、細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況，拍照記錄。
　　2.4BMSCs的鑒定
　　2.4.1BMSCs的定向誘導(dǎo)分化
　　2.4.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物
　　3.結(jié)果:
　　3.1BMSCs形態(tài)學(xué)觀察骨髓細(xì)胞接種子培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞呈圓型，大小不一，懸浮于培養(yǎng)液中。24小時后部分細(xì)胞開始貼壁生長，呈圓形、梭形或多角形。通過換液去除未貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞。48-72小時后可見放射狀排列的細(xì)胞集落，梭形細(xì)胞為主。3-5天后細(xì)胞

4、呈集落生長，融合80％-90％。12-14天細(xì)胞排列緊密，逐漸融合成片。消化傳代后，傳代細(xì)胞24小時完全貼壁生長。細(xì)胞呈梭形生長，生長旺盛。4-5天傳代1次，可穩(wěn)定連續(xù)傳代10代以上，細(xì)胞形態(tài)及生長速度無明顯變化。
　　3.2BMSCs成骨誘導(dǎo)分化鑒定大鼠P3代BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)第21天行茜素紅染色，可見紅染的鈣結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中心透光度較差，四周輪廓模糊，呈淡紅色的暈輪區(qū)。
　　3.3BMSCs成脂誘導(dǎo)分化鑒定大鼠P3代

5、BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)第14天，細(xì)胞內(nèi)脂滴大量形成、合并呈串珠狀。油紅O染色為陽性，細(xì)胞內(nèi)脂滴呈橘紅色。
　　3.4流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果培養(yǎng)的P3代大鼠BMSCs均一表達(dá)CD29，CD90，陽性率分別為93.16％，86.94％;而CD34呈陰性表達(dá)，陽性率分別為1.65％和1.57％。
　　4.結(jié)論:
　　本研究采用全骨髓貼壁法結(jié)合密度梯度離心法分離的大鼠BMSCs在形態(tài)學(xué)與生長動力學(xué)上均符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征

6、。在成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，分別出現(xiàn)成骨、成脂表型特征，說明其可向這兩種細(xì)胞分化，并通過細(xì)胞表達(dá)一些特異性表面抗原，證實了本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性，獲得了數(shù)量足、純度高、增殖能力強(qiáng)且生物學(xué)特征穩(wěn)定的BMSCs，為組織工程提供充足的種子細(xì)胞打下堅實的基礎(chǔ)。
　　第二部分:博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的建立方法及比較
　　1.目的:
　　本研究擬選用BLM作為誘導(dǎo)劑，分別經(jīng)腹腔、氣管給藥誘導(dǎo)大鼠發(fā)生

7、PF，動態(tài)觀察兩種大鼠PF模型肺組織形態(tài)學(xué)與羥脯氨酸含量等的變化，以探討一種更近似于人類PF病程的動物模型建立方法。
　　2.方法:
　　健康雄性SD大鼠80只，分別經(jīng)氣管、腹腔給予BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化。隨機(jī)分為①氣管給藥模型組(modelA):一次性氣管內(nèi)注入博萊霉素(5mg/kg)，分別于給藥后第7、14、21天活殺10只，為model A7、modelA14、modelA21組;②氣管給藥對照組(controlA):

8、大鼠在相同條件下經(jīng)氣管注入等量生理鹽水，余同model A組，于第21天活殺10只;③腹腔給藥模型組(modelB):大鼠每日左下腹腔注射博萊霉素(15mg/kg)，連續(xù)5天。分別于給藥后第7、14、21天活殺10只，為modelB7、modelB14、modelB21組;④腹腔給藥對照組(controlB):每日腹腔內(nèi)給予等量生理鹽水，余同modelB組，于第21天活殺10只。
　　3.結(jié)果:
　　3.1各組大鼠起始體重并

9、無差別。給予博萊霉素后，大鼠的體重值均有降低(P均＜0.01)。
　　3.2與對照組相比，給藥大鼠W/D、IQA值均有升高（P均＜0.01）;腹腔給藥組與氣管給藥組相同時相點比較，W/D、IQA值明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。
　　3.3肺組織羥脯氨酸(HYP)含量變化:兩種大鼠模型HYP含量均自第7、14天開始升高，第21天達(dá)高峰，腹腔給藥組大鼠HYP含量明顯高于氣管給藥組(P＜0.01)。
　　3.4肺泡

10、灌洗液檢測結(jié)果:與對照組相比，各給藥組大鼠肺泡灌洗液中TNF-a與IL-6的含量均明顯增加，且隨時間的延長含量也逐漸增多。與氣管給藥組相同時相點比較，腹腔給藥組肺組織TNF-a與IL-6的含量明顯上調(diào)。
　　3.5免疫組織化學(xué)結(jié)果:與對照組相比，給藥組大鼠肺小靜脈TGF-β的含量均明顯增加（P＜0.01），且隨時間的延長TGF-β的含量也逐漸增多(P＜0.01)，至給藥后第21天達(dá)高峰。與氣管給藥組相同時相點比較，腹腔給藥組肺小靜

11、脈TGF-β蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽性細(xì)胞主要分布于肺泡上皮細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　3.6肺組織切片HE染色光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠肺泡壁完整，肺泡間隔未增厚;BLM處理組第7天可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，組織水腫;第14天肺泡間隔增寬，結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)纖維化病灶;第21天肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，形成廣泛纖維化。氣管給藥組大鼠肺泡壁厚度較腹腔給藥組大鼠增厚明顯;腹腔給藥組大鼠胸膜較氣管給藥組明顯增厚。
　　3.7肺組

12、織切片電鏡下肺組織超微結(jié)構(gòu)顯示，BLM處理組肺微小動脈，微小靜脈及毛細(xì)血管的內(nèi)皮和基底膜有不同程度的損害;肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞均有不同程度的損傷。
　　3.8肺組織HYP與W/D、IQA之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系;HYP與TNF-a、IL-6和TGF-β蛋白之間亦存在非常顯著的正相關(guān)關(guān)系。
　　4.結(jié)論:
　　4.1本研究分別通過氣管和腹腔給予BLM，可致大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，呈現(xiàn)典型的肺纖維化病變，兩種給藥方法均可成功

13、制備博萊霉素致大鼠PF動物模型。
　　4.2BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化過程中，可能通過促進(jìn)肺組織中TNF-α、IL-6和TGF-β的產(chǎn)生，引起炎癥介質(zhì)對支氣管肺泡上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和異常修復(fù)，破壞肺泡-毛細(xì)血管膜的完整性，刺激成纖維細(xì)胞異常增殖和膠原合成增加，從而促進(jìn)肺部炎癥反應(yīng)和肺纖維化的發(fā)病。
　　4.3腹腔給藥具有操作快捷、簡便、死亡率低、個體間差異小等優(yōu)點，可以降低因手術(shù)操作熟練程度不同而造成動物纖維化程度的差異;

14、且腹腔給藥引起膠原代謝紊亂程度重、形成的病變主要位于胸膜下，與人類IPF的影像學(xué)表現(xiàn)接近。腹腔內(nèi)給藥誘導(dǎo)動物發(fā)生PF可能是較為理想的模型制作方法。
　　第三部分:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對博萊霉素致大鼠肺纖維化干預(yù)效應(yīng)的研究
　　1.目的:
　　本研究擬腹腔內(nèi)少量多次注射BLM制備PF動物模型，通過尾靜脈輸注BMSCs，使其定植于受損肺組織，分別從動物、器官、細(xì)胞及分子水平觀察BMSCs對PF的治療作用及其可能機(jī)制，為臨床防治

15、IPF提供實驗理論依據(jù)。
　　2.方法:
　　體外分離、培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，傳至第四代用于實驗。
　　3.結(jié)果:
　　3.1與Control組比較，BLM組和BLM+BMSC組W/D值和HYP含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01);與BLM組大鼠比較，BLM+BMSC組W/D值與HYP含量明顯降低(P＜0.01)。
　　3.2HE和MASSON染色顯示BMSCs顯著降低大鼠肺泡炎和肺纖維化的程度。<

16、br>　　3.3生化指標(biāo)檢測顯示:與Control組相比，BLM組大鼠血漿SOD活性顯著降低(P＜0.01)，MDA含量顯著增高(P＜0.01);與BLM組相比，間充質(zhì)干細(xì)胞治療組大鼠血漿SOD活性明顯上調(diào)，MDA含量顯著降低(P＜0.01)。
　　3.4Western-blot結(jié)果顯示:與Control組比較，BLM組大鼠肺組織Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P均＜0.01）;與BLM組比較，BL

17、M+BMSC組大鼠肺組織中Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。
　　3.5相關(guān)性分析結(jié)果顯示:Nrf2蛋白和NQO1、HO-1、γ-GCS蛋白存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。
　　4.結(jié)論:
　　4.1BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，激活了機(jī)體內(nèi)源性抗氧化信號通路Nrf2-ARE。肺纖維化大鼠肺臟存在明顯的氧化應(yīng)激損傷和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。激活的Nrf2-