骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌功能在肺纖維化修復(fù)中的作用.pdf

1、目的：通過氣管內(nèi)灌注鹽酸博萊霉素建立大鼠肺纖維化模型。觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)大鼠肺纖維化的干預(yù)作用并探討其機(jī)制，為肺纖維化的治療提供新的思路。
　　 方法：制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，選4周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，原代培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，傳至3、4代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)24小時(shí)，收集的培養(yǎng)基即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。分別收集1.0×106、4.0×106、8.0×106個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基

2、，超濾濃縮后低溫保存?zhèn)溆谩?br>　　 將50只SPF級(jí)雄性180-200gSD大鼠隨機(jī)化分為正常對(duì)照組、模型組、治療組A、治療組B、治療組C五大組，每組10只。腹腔注射水合氯醛麻醉動(dòng)物，將模型組和各治療組大鼠直視下經(jīng)口氣管插管，經(jīng)氣管內(nèi)注入鹽酸博萊霉素（5mg/kg），直立旋轉(zhuǎn)動(dòng)物復(fù)制肺纖維化疾病模型。正常對(duì)照組氣管內(nèi)注入相同體積生理鹽水。
　　 治療組A在造模次日經(jīng)尾靜脈注入1.0×106骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的濃縮條件培養(yǎng)基；

3、治療組B在造模次日經(jīng)尾靜脈注入4.0×106骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的濃縮條件培養(yǎng)基；治療組C在造模次日經(jīng)尾靜脈注入8.0×106骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的濃縮條件培養(yǎng)基；模型組在造模次日經(jīng)尾靜脈注入單純DMEM/F-12濃縮培養(yǎng)基。
　　 于造模后第21天處死全部動(dòng)物。將肺組織進(jìn)行HE染色及Masson三色染色，評(píng)估肺纖維化程度；肺組織行抗α-SMA（α-平滑肌肌動(dòng)蛋白）免疫組化；堿水解法測(cè)定肺組織羥脯氨酸（HYP）含量；real-timeP

4、CR檢測(cè)肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1mRNA）、TNF-αmRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）mRNA表達(dá)的變化；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定肺組織勻漿中TGF-β1、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）含量。
　　 結(jié)果：(l) 博萊霉素氣管內(nèi)注藥的方法成功構(gòu)建了大鼠肺纖維化模型；（2）免疫組化顯示模型組肺組織α-平滑

5、肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)較對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)均較模型組減輕(P<0.05），治療組B、C肺組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)較A組有進(jìn)一步減輕(P<0.05），治療組B、C肺組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（3）病理學(xué)半定量分析顯示模型組肺組織纖維化程度較對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺纖維化程度均較模型組減輕 (P<0.05）。治療組B、C肺纖維化程度較A組

6、有進(jìn)一步減輕(P<0.05）。治療組B、C肺纖維化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（4）模型組肺組織HYP含量較對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺組織HYP含量均較模型組減低(P<0.05），治療組B、C肺組織HYP含量較A組有進(jìn)一步減輕(P<0.05），治療組B、C肺組織HYP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（5）real-time PCR檢測(cè)肺組織TGF-β1mRNA 顯示模型組肺組織TGF-β1mRNA含量

7、較對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺組織TGF-β1mRNA含量均較模型組減少(P<0.05），治療組B、C肺組織TGF-β1mRNA含量較A組有進(jìn)一步減輕(P<0.05），治療組B、C肺組織TGF-β1mRNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（6）real-time PCR檢測(cè)肺組織TNF-αmRNA顯示模型組肺組織TNF-αmRNA含量較對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺組織TNF-αmRNA含量均較模

8、型組減少(P<0.05），治療組B、C肺組織TNF-αmRNA含量較A組有進(jìn)一步減少(P<0.05），治療組B、C肺組織TNF-αmRNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（7）real-time PCR 檢測(cè)肺組織MMP-9mRNA顯示模型組、對(duì)照組肺組織MMP-9mRNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05），治療組A、B、C肺組織MMP-9mRNA含量均較模型組、對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺組織MMP-9mRN

9、A 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（8）real-time PCR檢測(cè)肺組織TIMP-1mRNA顯示對(duì)照組、模型組、治療組A、治療組B、治療組C五組TIMP-1mRNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（9）ELISA測(cè)定肺組織勻漿中TGF-β1顯示模型組肺組織勻漿TGF-β1含量較對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺組織勻漿TGF-β1含量均較模型組減少(P<0.05），治療組B、C肺組織勻漿TGF-β1含量較A

10、組有進(jìn)一步減輕(P<0.05），治療組B、C肺組織勻漿TGF-β1含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（10）ELISA測(cè)定肺組織勻漿中TNF-α顯示模型組肺組織勻漿TNF-α含量較對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺組織勻漿TNF-α含量均較模型組減少(P<0.05），治療組B、C肺組織勻漿TNF-α含量較A組有進(jìn)一步減輕(P<0.05），治療組B、C肺組織勻漿TNF-α含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（11）ELI

11、SA測(cè)定肺組織勻漿中MMP-9顯示模型組、對(duì)照組肺組織勻漿中MMP-9含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05），治療組A、B、C肺組織勻漿中MMP-9含量均較模型組、對(duì)照組增高(P<0.05），治療組A、B、C肺組織勻漿中MMP-9含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；（12）ELISA測(cè)定肺組織勻漿中TIMP-1 顯示對(duì)照組、模型組、治療組A、治療組B、治療組C五組肺組織勻漿TIMP-1 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）。
　　

12、 結(jié)論：（1）博萊霉素氣管內(nèi)注藥的方法可成功構(gòu)建大鼠肺纖維化模型；（2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能減輕肺纖維化。（3）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基治療組大鼠肺組織TGF-β1、TNF-α下降明顯，說明其減緩肺纖維化可能與抑制TGF-β1、TNF-α的分泌有關(guān)，同時(shí)說明TGF-β1、TNF-α可能在肺纖維化過程中起關(guān)鍵作用。（4）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基治療組大鼠肺組織中MMP-9升高明顯，推測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基減