臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療放射性肺纖維化的初步探索.pdf

1、放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤（肺癌、食管癌、乳腺癌、胸腺瘤等）進(jìn)行放射治療時(shí)引起的正常肺組織損傷。美國放射腫瘤治療協(xié)作組(RTO)根據(jù)肺損傷發(fā)生在放療后的不同時(shí)間分為:放療后3月內(nèi)出現(xiàn)的急性放射性損傷(Acute radiation-induced pneumonitis，ARP)和放療3月后出現(xiàn)的放射性肺纖維化(Radiation-induced pulmonary fibrosis，RPF)。目前用于治療放射性肺損傷的糖皮質(zhì)激素、免疫

2、抑制劑和中醫(yī)藥等能夠緩解早期癥狀，但對(duì)晚期的放射性肺纖維化無效。所以迫切需要尋找一個(gè)有效的治療手段。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，因其具有自動(dòng)歸巢到受損部位、分化為組織細(xì)胞、旁分泌等特點(diǎn)廣泛用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?，F(xiàn)研究最廣的MSCs主要來源于脂肪、臍帶和骨髓?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)臍帶來源的MSCs(Umbilical cord mesenchymal

3、stem cells，UC-MSCs)較另外兩種來源的MSCs具有取材更方便、細(xì)胞活力更強(qiáng)、免疫原性更弱、分泌更多細(xì)胞因子等優(yōu)勢(shì)。目前國內(nèi)外已陸續(xù)開展了一些MSCs治療肺部疾?。毙院粑狡染C合征、特發(fā)性肺纖維化、細(xì)支氣管肺泡炎等）的初步臨床研究，均未發(fā)生嚴(yán)重不良事件。因上述研究多為小樣本研究，其有效性需Ⅱ期臨床研究證實(shí)。MSCs治療上述疾病的移植方法主要有腹腔內(nèi)、氣管、靜脈植入三種方式。已有研究者在肺損傷幼鼠模型中證實(shí)MSCs經(jīng)氣管植

4、入安全且療效優(yōu)于靜脈植入。關(guān)于MSCs治療肺部疾病的劑量研究顯示單次植入1×106/kg至1×108/kg之間是安全的。雖然MSCs治療肺部急慢性疾病的臨床研究取得了初步成就，但是目前尚無MSCs治療RPF的相關(guān)報(bào)道。
　　已有基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示脂肪來源的MSCs通過分泌肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)和前列腺素-2（Prostaglandin-2，PGE-2）降低射線導(dǎo)致的大鼠肺組織纖維化

5、損傷;骨髓來源的MSCs能夠提高射線輻照小鼠的存活率，肺組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)MSCs治療組的膠原沉積減少，MSCs治療組TNF-α的分泌增加，IL-10的分泌減少;因此存在MSCs治療RPF的可行性。但是MSCs治療RPF的前提是MSCs或MSCs的條件培養(yǎng)基對(duì)原發(fā)的胸部腫瘤無增殖促進(jìn)作用。目前，有關(guān)MSCs對(duì)腫瘤的影響的研究結(jié)果有很多是矛盾的，多數(shù)專家認(rèn)為MSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖促進(jìn)還是抑制與腫瘤類型和MSCs的組織來源密切相關(guān)。因此，有必要

6、在進(jìn)行RPF的臨床試驗(yàn)實(shí)施前確定我們選用的臨床級(jí)UC-MSCs或MSCs的條件培養(yǎng)基對(duì)肺癌細(xì)胞的影響。
　　基于以上背景，為探索UC-MSCs治療RPF的安全性和有效性。本研究先從細(xì)胞水平觀察UC-MSCs對(duì)RPF原發(fā)腫瘤增殖影響，隨后從臨床水平初步探索UC-MSCs治療RPF的安全性和有效性，為其進(jìn)一步臨床研究提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.了解UC-MSCs對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響;
　　2.初步探索UC-M

7、SCs治療RPF的安全性和有效性;
　　3.觀察UC-MSCs治療RPF患者前后血清和支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β1等細(xì)胞因子的變化。
　　內(nèi)容：
　　1.UC-MSCs對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響
　　1.1UC-MSCs條件培養(yǎng)基對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響
　　收集12h、24h、48h的UC-MSCs條件培養(yǎng)基分別

8、與H446和H157細(xì)胞共培養(yǎng)，連續(xù)共培養(yǎng)6天，每天同一時(shí)間采取MTT、CCK和細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)上述兩種腫瘤細(xì)胞的增殖情況。
　　1.2UC-MSCs對(duì)H446細(xì)胞增殖的影響
　　選用P5-P10代的UC-MSCs與H446細(xì)胞按1∶1、2∶1、3∶1比例共培養(yǎng)，連續(xù)共培養(yǎng)6天，每間隔1h使用IncuCyte軟件檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖情況。
　　2.UC-MSCs治療RPF的臨床觀察
　　2.1UC-MSCs治療RP

9、F的安全性
　　根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)入組RPF患者，在UC-MSCs植入前、植入后3天、植入后3月、植入后6月收集外周血，檢查血常規(guī)、肝腎功了解有無毒理學(xué)影響，并觀察UC-MSCs植入前后有無皮膚過敏、心血管等不良事件。
　　2.2UC-MSCs治療RPF的有效性
　　在UC-MSCs植入前、植入后3月、植入后6月行6min步行距離(Six-minute walk distance，6MWD)、圣喬治問卷（St George'

10、s Respiratory Questionnaire，SGRQ）、肺功能和胸部CT檢查和觀察臨床癥狀變化情況。
　　2.3UC-MSCs治療RPF的細(xì)胞因子變化
　　在UC-MSCs植入前收集外周血，檢測(cè)血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Mysterious motorist program-1，MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-7(Mysterious motor

11、ist program-7，MMP-7)等細(xì)胞因子，通過纖支鏡對(duì)RPF病灶部位灌洗收集BALF重復(fù)查上述細(xì)胞因子，然后單次植入U(xiǎn)C-MSCs(劑量為1×106/kg)在UC-MSCs植入治療后第3天和植入后第3月檢測(cè)血清上述細(xì)胞因子，第6月檢測(cè)血清和BALF中上述細(xì)胞因子。
　　結(jié)果：
　　1.UC-MSCs對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響
　　1.1UC-MSCs條件培養(yǎng)基對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響
　　在共培養(yǎng)前5天，UC-M

12、SCs條件培養(yǎng)基對(duì)H446細(xì)胞和H157細(xì)胞增殖影響不明顯。在共培養(yǎng)第6天，12h的UC-MSCs條件培養(yǎng)基對(duì)H446細(xì)胞和H157細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，48h的UC-MSCs條件培養(yǎng)基對(duì)上述細(xì)胞增殖有抑制作用。且抑制程度可能與共培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)。
　　1.2UC-MSCs對(duì)H446細(xì)胞增殖的影響
　　UC-MSCs與H446細(xì)胞在不同比例下共培養(yǎng)均不促進(jìn)H446細(xì)胞增殖，且在1∶1的條件下能夠抑制上述細(xì)胞增殖。
　　2

13、.UC-MSCs治療RPF的臨床觀察
　　2.1UC-MSCs治療RPF的安全性
　　2.1.1血常規(guī)（紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞、血小板），肝功（轉(zhuǎn)氨酶），腎功（肌酐、尿素氮、尿素）在UC-MSCs治療前后變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;UC-MSCs植入前后未發(fā)現(xiàn)皮膚過敏和心血管不良事件。
　　2.2UC-MSCs治療RPF的有效性
　　2.2.18例RPF患者中有6例自覺氣促、咳嗽等呼吸道癥狀明顯好轉(zhuǎn);

14、r>　　2.2.2CT肺密度值在UC-MSCs植入前與植入后第3月、第6月自身前后比較有下降;
　　2.2.3圣喬治呼吸問卷在UC-MSCs植入前與植入后第3月、第6月比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，6分鐘步行距離變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　2.2.4肺功能指標(biāo)FEV1、MVV、DLCO在UC-MSCs植入后第3月、第6月較前有改善，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.3UC-MSCs治療RPF的細(xì)

15、胞因子變化
　　血清和灌洗液中TGF-β1在UC-MSCs植入前與植入后比較有下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、48h的UC-MSCs條件培養(yǎng)基對(duì)H446、H157細(xì)胞增殖有抑制作用;且抑制程度均可能與共培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)。UC-MSCs與H446細(xì)胞在不同比例下共培養(yǎng)均不促進(jìn)H446細(xì)胞增殖，且在1∶1的條件下能夠抑制上述細(xì)胞增殖。
　　2、臨床觀察UC-MSCs治療RPF未發(fā)現(xiàn)對(duì)肝