人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠梗阻性腎間質(zhì)纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：分離、培養(yǎng)和鑒定人UC-MSCs，觀察異種UC-MSCs靜脈移植的安全性及UC-MSCs在UUO大鼠體內(nèi)的分布，探討人UC-MSCs移植治療梗阻性腎間質(zhì)纖維化的可行性，分析UC-MSCs移植抗纖維化的可能機(jī)制，為臨床UC-MSCs移植治療慢性腎臟疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.無(wú)菌條件下取新鮮臍帶，采用聯(lián)合酶序貫消化法分離UC-MSCs，并通過(guò)傳代進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，繪制生長(zhǎng)曲

2、線；進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇，觀察細(xì)胞的穩(wěn)定性；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)UC-MSCs表面抗原；誘導(dǎo)向成骨、脂肪細(xì)胞分化以觀察其多項(xiàng)分化潛能。凍存的UC-MSC復(fù)蘇、擴(kuò)增，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml備用。
　　 2.8周齡雌性SD大鼠84只隨機(jī)分為4組，各21只：①單側(cè)輸尿管梗阻組(UUO組)：。大鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，術(shù)后7d尾靜脈注射PBS1ml。②單側(cè)輸尿管梗阻+細(xì)胞移植組(UUO+MSCs組)：大鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，術(shù)后7d尾靜

3、脈注射5×106UC-MSCs。③假手術(shù)組(Sham組)：手術(shù)入路方式同UUO組，進(jìn)腹腔后分離左輸尿管但不結(jié)扎輸尿管，術(shù)后7d經(jīng)尾靜脈注射PBS1ml。④假手術(shù)+細(xì)胞移植組(Sham+MSCs組)：手術(shù)入路方式同UUO組，進(jìn)腹腔后分離左輸尿管但不結(jié)扎輸尿管，術(shù)后7d尾靜脈注射5×106UC-MSCs。四組大鼠分別于造模后14d、21d、28d共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取7只殺鼠，造模后和殺鼠前均測(cè)量體重，殺鼠后收集血標(biāo)本、腎臟、心臟、肝臟、脾臟和肺

4、，行以下檢查：①血標(biāo)本檢測(cè)血常規(guī)、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶；②四組大鼠腎組織均行蘇木精-伊紅(HE)、過(guò)碘酸希夫反應(yīng)(PAS)和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織的形態(tài)學(xué)改變；③免疫組化染色檢測(cè)四組大鼠心、肝、脾、肺、腎組織MAB1281(標(biāo)記人UC-MSCs)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，光鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　　 3.8周齡雌性SD大鼠63只隨機(jī)分為UUO組、UUO+MSCs組和Sham組，每組各21只，模型的制備和細(xì)胞移

5、植的劑量同前。三組大鼠分別于造模后14d、21d、28d共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取7只殺鼠，殺鼠后收集24小時(shí)尿液、血標(biāo)本和腎臟，行以下檢查：①尿標(biāo)本行24h尿蛋白含量檢測(cè)，血標(biāo)本檢測(cè)血清尿素氮和肌酐水平；②三組大鼠腎組織光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織的形態(tài)學(xué)改變，并對(duì)腎小管間質(zhì)損害進(jìn)行評(píng)分；③免疫組化染色檢測(cè)三組大鼠腎組織α-SMA、Fn、TGF-β1和BMP-7的表達(dá)，光鏡下觀察陽(yáng)性反應(yīng)，測(cè)量黃色部分的累積光密度并計(jì)算平均光密度。④Western b

6、lot進(jìn)一步檢測(cè)腎組織α-SMA、Fn、TGF-β1和BMP-7的蛋白定量，測(cè)量陽(yáng)性條帶的光密度值并計(jì)算與β-tubulin的光密度比值。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)酶消化后的原代細(xì)胞多于24-48小時(shí)內(nèi)貼壁，1周以后增長(zhǎng)速度較快，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)，于第2、3周可形成大于80％融合貼壁細(xì)胞層；凍存后復(fù)蘇的P4代細(xì)胞，生長(zhǎng)速度較快，倍增時(shí)間均約為28h，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變；P2代臍帶來(lái)源貼壁細(xì)胞成骨定向誘導(dǎo)14天

7、，可見(jiàn)細(xì)胞間布滿黑色顆粒，提示有礦化基質(zhì)沉積，成脂肪定向誘導(dǎo)14天后，可見(jiàn)油紅-O染色呈強(qiáng)陽(yáng)性；流式細(xì)胞儀細(xì)胞免疫表型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)臍帶源貼壁細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等MSCs標(biāo)記物，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31和HLA-DR。
　　 2.各時(shí)間點(diǎn)Sham+MSCs組的體重增長(zhǎng)、血常規(guī)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平與Sham組比較差異沒(méi)有顯著性意義(P>0.05)。②

8、UUO組和UUO+MSCs組結(jié)扎側(cè)腎臟隨時(shí)間的延長(zhǎng)，間質(zhì)纖維化程度逐步加重，腎小球無(wú)明顯病變。③四組大鼠心、肝、脾、肺大體標(biāo)本肉眼觀察均無(wú)明顯異常。Sham+MSCs組心、肝、脾、肺、腎組織光鏡下未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。④外源性的UC-MSCs主要分布在肺和脾臟，其次是腎臟和心肌，肝臟幾乎沒(méi)有。UUO+MSCs組脾臟的UC-MSCs明顯少于Sham+MSCs組(P<0.01)，但腎臟的UC-MSCs卻多于Sham+MSCs組，而且UUO+

9、MSCs組的左腎UC-MSCs主要分布在腎間質(zhì)，Sham+MSCs組的腎臟UC-MSCs卻主要分布在腎小球。
　　 3.①各時(shí)間點(diǎn)三組間24h尿蛋白排出量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。術(shù)后第14天，UUO+MSCs組與UUO組相比，血肌酐值下降，差異有顯著性意義(P<0.05)。②術(shù)后14天和21天，UUO+MSCs組大鼠腎小管間質(zhì)的病理積分、腎組織Fn和α-SMA免疫組化平均光密度和蛋白表達(dá)均低于UUO組(P<0.05)，但術(shù)

10、后28天兩組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。③術(shù)后第14天和28天，與UUO組相比，UUO+MSCs組腎組織TGF-β1免疫組化平均光密度和蛋白表達(dá)均減少，但BMP-7平均光密度和蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。④腎組織中α-SMA的表達(dá)與TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)，而與BMP-7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.聯(lián)合酶序貫消化法能成功分離人UC-MSCs，經(jīng)傳代、凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞特性無(wú)明顯改變。培養(yǎng)的細(xì)胞具有MSC