骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和苯妥英鈉中介的旁分泌機(jī)制在心肌梗死后組織修復(fù)中的作用.pdf

1、背景：心肌梗死(MI)后心肌細(xì)胞的喪失和病理性心室重塑是進(jìn)展為心功能不全的主要成因。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的心臟修復(fù)為重建受損心肌帶來希望?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究在證實(shí)細(xì)胞移植安全可行的基礎(chǔ)上，顯示其介導(dǎo)的組織修復(fù)很大程度上受益于強(qiáng)大的旁分泌作用，即促進(jìn)血管形成、抑制細(xì)胞凋亡、激活內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制。苯妥英鈉(PHT)具有促進(jìn)結(jié)締組織增生的藥理特性，研究證實(shí)PHT可誘導(dǎo)表皮成纖維細(xì)胞多種生長(zhǎng)因子及其受體表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)生長(zhǎng)因子的自分泌或旁分泌活性，即PH

2、T中介的旁分泌作用。最近，有報(bào)道PHT可靶向性地促進(jìn)MI大鼠梗死區(qū)的膠原沉積與成熟，加速梗死區(qū)的基質(zhì)修復(fù)，但具體機(jī)制尚不十分清楚。 目的：建立大鼠心肌60分鐘缺血再灌注(I/R)模型，給與同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)心肌內(nèi)注射、PHT腹腔內(nèi)注射或者二者的聯(lián)合應(yīng)用，觀察MI 后血管形成和左室重塑的變化，評(píng)價(jià)心功能，并檢測(cè)梗死區(qū)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2

3、)、組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的蛋白表達(dá)水平，在證實(shí)MSCs和PHT 改善MI后組織修復(fù)的基礎(chǔ)上，探索二者聯(lián)合應(yīng)用的綜合效應(yīng)，分析MSCs和PHT介導(dǎo)的旁分泌機(jī)制在心肌修復(fù)中的可協(xié)同性。 方法：56只建模成功并存活的雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(12只)、對(duì)照組(12只)、PHT組(12只)、MSCs組(11只)以及MSCs+PHT組(9只)。采用全血貼壁法培養(yǎng)的3-4代MSCs在移植前用熒光

4、染料DAPI標(biāo)記，于建?；謴?fù)再灌注之時(shí)按照1×10<'6>/100μL/只的劑量注射至梗死周邊區(qū)域。對(duì)照組和PHT組注射細(xì)胞培養(yǎng)基。PHT組和MSCs+PHT組在建模后，連續(xù)14天給與腹腔內(nèi)注射 PHT 75mg/kg/day。術(shù)后第7天，各組分別處死 6、6、6、5、5只，留取心臟標(biāo)本，通過苦味酸-天狼猩紅染色測(cè)定梗死范圍、膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)等，結(jié)合偏振光顯微鏡分析梗死區(qū)膠原成熟程度，麥胚凝集素 (WGA) 熒光染色測(cè)定室間隔心肌

5、細(xì)胞橫截面積(CSA)；vWF和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)免疫熒光染色分別計(jì)算梗死區(qū)及其邊緣的毛細(xì)血管和小動(dòng)脈密度；Western blot檢測(cè)梗死區(qū)VEGF、bFGF、MMP-2 和 TIMP-1 的蛋白表達(dá)水平。術(shù)后第28天，各組剩余動(dòng)物進(jìn)行有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)檢查，測(cè)定主動(dòng)脈收縮壓(SBP) 和舒張壓(DBP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率和最大下降速率(+dp/dt<,max>及-dp/dt)。隨后

6、處死并留取心臟標(biāo)本，進(jìn)行病理學(xué)分析，所測(cè)指標(biāo)與術(shù)后第7天相同。 結(jié)果：1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)結(jié)果：1)體外培養(yǎng)的大鼠MSCs呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)多樣，以梭形多見。原代MSCs生長(zhǎng)緩慢，一代以后細(xì)胞增殖迅速。2)第3、4代MSCs經(jīng)DAPI標(biāo)記后，細(xì)胞核著色，紫外光激發(fā)呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞核多為圓形或卵圓形。3)MSCs移植至梗死邊緣區(qū)后，術(shù)后第7天、第28天的心臟組織切片顯示，存活的MSCs主要分布于梗死區(qū)邊緣和梗死區(qū)內(nèi)。部分DAPI標(biāo)記的MS

7、Cs表達(dá)vWF或α-SMA，提示MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞，參與毛細(xì)血管、小動(dòng)脈的發(fā)生。 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1)病理學(xué)大體指標(biāo)：①梗死范圍：術(shù)后第7天，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后第28天，和對(duì)照組(41.80±5.21％)比較，PHT組、MSCs組和MSCs±PHT組梗死范圍減小，而且MSCs組和MSCs+PHT組梗死范圍小于PHT組(P<0.05)；②梗死區(qū)室壁厚度：術(shù)后第7天，和對(duì)照組比較，MSCs組和

8、Mscs+PHT組室壁厚度增大；術(shù)后第28天，和對(duì)照組(1.44±0.30mm)比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組室壁厚度增大，而且MSCs組和MSCs+PHT組室壁厚度大于PHT組；③膨展指數(shù)：術(shù)后第7、28天，和對(duì)照組比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組膨展指數(shù)均減小；而且術(shù)后第28天，MSCs組和MSCs+PHT組膨展指數(shù)小于PHT組；④室間隔心肌細(xì)胞CSA：術(shù)后第7、28天，和對(duì)照組比較，PHT組、MSCs

9、組和MSCs+PHT組CSA均減小；2)膠原分析：①梗死區(qū)CVF：術(shù)后第7天，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后第28天，和對(duì)照組比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組CVF均減??；②梗死區(qū)膠原成熟程度：術(shù)后第7天，各組間比較無差異；術(shù)后第28天，和對(duì)照組或PHT組比較，MSCs組和MSCs+PHT組膠原成熟度均減小(P<0．01)；和術(shù)后第7天比較，對(duì)照組和PHT組術(shù)后第28天膠原成熟度均增大(P<0．01)；③室間隔CVF：術(shù)

10、后第28天，和對(duì)照組比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組CVF均減小(P<0．01)；3)免疫熒光染色結(jié)果：①毛細(xì)血管密度(vWF染色)：術(shù)后第7天，和對(duì)照組(84．00±16．73/mm<'2>)比較，MSCs組和MSCs+PHT組毛細(xì)血管密度增大；而且MSCs+PHT組毛細(xì)血管密度高于PHT組(160．00±34．14/mm<'2> vs．110．00±23．66/mm<'2>，P<0．05)；術(shù)后第28天，和假手術(shù)組或?qū)?/p>

11、照組比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組毛細(xì)血管密度均增大；而且MSCs+PHT組毛細(xì)血管密度高于PHT組(100．00±19．15/mm<'2>vs．71．00±16．02/mm<,2>，P<0．05)；②小動(dòng)脈密度(α-SMA染色)：術(shù)后第7天，和對(duì)照組(10．16±3．35/mm<'2>)或PHT組比較，MSCs組和MSCs+PHT組小動(dòng)脈密度均增大；術(shù)后第28天，和對(duì)照組(12．96±4．33/mm<'2>)比較，PH

12、T組、MSCs組以及MSCs+PHT組小動(dòng)脈密度均增大； 4)Western blot 檢測(cè)結(jié)果：①VEGF和bFGF：假手術(shù)組左室游離壁幾乎沒有VEGF或bFGF蛋白的表達(dá)，余4組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；bFGF蛋白水平測(cè)定有依次升高趨勢(shì)，以MSCs組和MsCs+PHT組為著；②MMP-2：和假手術(shù)組比較，余4組MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著升高；4組間比較，蛋白表達(dá)水平無差異；③TIMP-1：PHT組TIMP-1蛋白表達(dá)水平低于其他各組，

13、剩余組間差異無顯著性；5)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果：3個(gè)處理組和對(duì)照組比較，SBP、DBP、LVEDP、+dp/dt<,max>以及-dp/dt<,max>的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1)MSCs移植主要通過旁分泌機(jī)制介導(dǎo)加速心肌修復(fù)、促進(jìn)血管形成、改善心室重塑的作用，但細(xì)胞移植顯著抑制梗死區(qū)的膠原成熟；2)PHT亦可通過旁分泌機(jī)制介導(dǎo)加速心肌修復(fù)、促進(jìn)血管新生、改善心室重塑的作用，但效果不如MSCs移植顯著；3)PHT依賴旁分泌作