小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變及骨橋蛋白表達(dá)研究.pdf

1、肺纖維化是許多肺部疾病的普遍結(jié)局和主要特點(diǎn)，以成纖維細(xì)胞不斷增殖致使細(xì)胞外基質(zhì)不斷沉積為主要特征。本研究著重從形態(tài)學(xué)上證實(shí)小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化病程中“上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(EMT)”過程及骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)變化，并利用藥物干預(yù)推測二者的潛在關(guān)系。 我們將78只健康雄性C57BL/6小鼠按其體重排序規(guī)律分為生理鹽水對照組(NS)、博來霉素(BLM)模型組和曲尼司特用藥組(BT)三個實(shí)驗(yàn)處理組。各組小鼠均在實(shí)驗(yàn)第一天采用口咽

2、抽吸法經(jīng)咽部注入氣管相應(yīng)的藥液：模型組及用藥組為50μl博來霉素溶液(濃度2mg/ml，劑量5mg/kg)，對照組為50μl生理鹽水；用藥組從造模第一天起，至相應(yīng)時間點(diǎn)為止，期間行曲尼司特藥液(濃度10mg/ml，250mg/kg，每天一次)灌胃。各組小鼠分別在造模后第3d、7d、14d、21d及28d 5個時間點(diǎn)斷頸處死后，取左肺制備石蠟切片，右肺液氮凍存后進(jìn)行相關(guān)蛋白Western-blot檢測。石蠟切片行蘇木素-伊紅染色(HE)及

3、苦味酸天狼星紅染色觀察肺組織形態(tài)變化及膠原生成情況；行表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白-C(SP-C)、上皮型鈣粘蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、成纖維細(xì)胞特異蛋白1(FSP1)和骨橋蛋白(OPN)免疫組織化學(xué)染色，觀察肺纖維化“上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(EMT)”形態(tài)與OPN表達(dá)情況，并利用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(IPP6.0)測量切片累積吸光度(IOD)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用液氮凍存肺組織對O

4、PN生成量進(jìn)行Western-blot半定量分析。 HE及苦味酸天狼星紅染色顯示出小鼠肺組織正常的及纖維化病變進(jìn)程中的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化；模型組小鼠肺組織膠原生成量隨時間推移而增加，且與對照組相比二組的膠原生成量具有顯著性差異(P<0.05)；用藥組小鼠肺組織膠原生成量略低于同時期模型組肺組織膠原生成量。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示OPN主要由氣管壁及血管壁平滑肌層、肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞生成；圖像分析及Western-blot半定

5、量分析均表明模型組OPN在病程初始的炎癥期開始表達(dá)，并隨病程進(jìn)展持續(xù)升高，在病程中后期的纖維化階段達(dá)到峰值；對照組OPN表達(dá)多見于氣管壁及血管壁平滑肌層，表達(dá)量很少且各時間點(diǎn)恒定，與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05)；Western-blot結(jié)果顯示用藥組OPN表達(dá)量略低于同時期模型組的表達(dá)量。 我們利用免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行EMT形態(tài)觀察。SP-C及E-Cadherin被選為肺上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白來觀察肺纖維化進(jìn)程中上皮細(xì)

6、胞的變化，F(xiàn)SP1及Vimentin被選為肺間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白來觀察肺纖維化進(jìn)程中間充質(zhì)細(xì)胞的變化。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SP-C由Ⅱ型肺泡細(xì)胞生成，對照組SP-C陽性Ⅱ型肺泡細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)正常且數(shù)量恒定，模型組SP-C表達(dá)量隨時間點(diǎn)推移有所增加，纖維化階段的多數(shù)肺實(shí)變區(qū)域的陽性細(xì)胞較為集中、數(shù)量較多且胞體肥大變形；用藥組與同時期模型組陽性細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)相比沒有明顯差別。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示E-Cadherin主要由氣管黏膜上皮及肺泡上

7、皮細(xì)胞生成，對照組表達(dá)量多，而模型組在肺實(shí)變部位幾乎未見表達(dá)，用藥組與同時期模型組陽性細(xì)胞的數(shù)量相比沒有明顯差別。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示FSP1主要由氣管及血管周邊區(qū)域及肺泡隔內(nèi)的成纖維細(xì)胞生成；對照組陽性細(xì)胞數(shù)較少，模型組的肺實(shí)變部位陽性細(xì)胞的表達(dá)顯著增多，用藥組與同時期模型組的陽性表達(dá)沒有顯著差別。Vimentin主要由氣管黏膜上皮及血管周、肺泡隔內(nèi)的成纖維細(xì)胞生成，對照組數(shù)量較少，模型組及用藥組的肺實(shí)變部位陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增多?？傊?/p>

8、，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，SP-C與FSP1、vimentin在肺纖維化的實(shí)變區(qū)域共同表達(dá)，這些蛋白的表達(dá)變化提示肺上皮細(xì)胞表型缺失，且獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性，所以我們推測BLM誘導(dǎo)的肺纖維化進(jìn)程中存在EMT。 綜上所述，根據(jù)EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)變化我們推論BLM誘導(dǎo)的肺纖維化中存在EMT，且與顯著增加的OPN有潛在關(guān)系，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中可針對性地使用OPN相應(yīng)抗體或OPN基因敲除等方法特異阻斷OPN在機(jī)體中發(fā)揮作用，來進(jìn)一步直接