hsA-miR-1246在胃腺癌上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生中的作用.pdf

1、背景與目的:胃癌(Gastric cancer，GC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤致死病因中高居第二位。其中，胃腺癌(Gastric adenocarcinoma)是胃癌的主要組織學(xué)類型，其發(fā)病率占胃惡性腫瘤發(fā)病率的95％。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因。因此，研究腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對降低癌癥惡性行為及提高患者生存質(zhì)量有重大意義。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，E

2、MT)是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，在腫瘤的演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用。大量研究表明miRNA參與了多種病理生理過程，它在EMT過程中的作用不可小覷。
　　文獻(xiàn)表明:血清miR-1246與食管鱗狀細(xì)胞癌的TNM分期有關(guān);miR-1246等六個血清miRNAs的表達(dá)水平能夠預(yù)測早期宮頸鱗狀細(xì)胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。p53及其類似物p63和p73能靶向作用于miR-1246，后者通過抑制 DYRK1A(dual

3、-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase1 A)的表達(dá)，進(jìn)而活化NFAT(nuclear factor of activated T cells)，從而引起細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌功能。本課題組在前期探討EGFL7與胃腺癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的過程中，發(fā)現(xiàn)在不同的處理組hsa-miR-1246（以下簡稱miR-1246）存在顯著的差異表達(dá)，因此我們推測miR-1246可能參與

4、了對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，其機(jī)制有待進(jìn)一步的深入探討。本研究擬以胃腺癌細(xì)胞株BGC823和胃腺癌、胃腺癌癌旁黏膜及胃黏膜良性病變（胃炎及胃潰瘍）組織石蠟塊為研究對象，初步探討miR-1246對胃癌發(fā)生和EMT的影響。
　　方法:(1)采用探針法熒光定量PCR在組織水平檢測高、中、低分化胃腺癌組織石蠟標(biāo)本miR-1246的相對表達(dá)水平。每組樣本隨機(jī)抽取相應(yīng)癌旁胃黏膜組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行其miR-1246相對表達(dá)水平的檢測。選取12例胃良性

5、病變（胃炎或胃潰瘍）的胃黏膜組織石蠟標(biāo)本，進(jìn)行其miR-1246相對表達(dá)水平的檢測。統(tǒng)計分析miR-1246的相對表達(dá)水平與胃黏膜腺體分化水平及臨床參數(shù)之間的關(guān)系。
　　(2)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)分析胃腺癌石蠟標(biāo)本中E-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平，分析其與miR-1246及各項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系。
　　(3)采用慢病毒作為載體，對BGC823細(xì)胞分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-1246前體及陰性對照，

6、在熒光顯微鏡下確定轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)嘌呤霉素篩選得到兩個穩(wěn)定細(xì)胞株。用探針法熒光定量PCR檢測miR-1246在BGC823 miR-1246過表達(dá)組、BGC823 mimics NC組和BGC823本底組的相對表達(dá)水平，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功，再用Western blotting檢測E-cadherin和vimentin在三組中的表達(dá)水平。拍照并觀察三組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:(1) miR-1246在胃腺癌、胃腺癌癌旁和胃良性病變黏膜組

7、織石蠟標(biāo)本中的相對表達(dá)水平有升高的趨勢，其中胃腺癌組和胃良性病變組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，余均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。miR-1246的相對表達(dá)水平在高分化、中分化和低分化胃腺癌組織石蠟標(biāo)本中有降低的趨勢，但兩兩之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。miR-1246的相對表達(dá)水平有隨TNM分期增高而降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(2) E-cadherin在胃腺癌中的表達(dá)水平隨組織分化

8、水平增高而增高，Vimentin隨之降低，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。E-cadherin在胃腺癌中的表達(dá)水平有隨TNM分期增高而降低，Vimentin隨之增高的趨勢，各組間差異除在E-cadherin的T stage組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。miR-1246在E-cadherin陽性組的相對表達(dá)水平高于E-cadherin陰性組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。miR-

9、1246在Vimentin陽性組的相對表達(dá)水平低于Vimentin陰性組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3) BGC823細(xì)胞株分別經(jīng)過慢病毒載體pre-hsa-miR-1246 mimics和慢病毒載體mimics陰性對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后（轉(zhuǎn)染效率在90～95％以上），建立了穩(wěn)定的BGC823 miR-1246高表達(dá)細(xì)胞株和BGC823 miR-1246陰性對照細(xì)胞株。BGC823 miR-1246高表達(dá)細(xì)胞株的miR-

10、1246的相對表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);E-cadherin蛋白表達(dá)水平在BGC823 miR-1246高表達(dá)細(xì)胞株中相對其它兩細(xì)胞株增高，vimentin蛋白表達(dá)水平在BGC823 miR-1246高表達(dá)細(xì)胞株中相對其它兩細(xì)胞株有所降低。BGC823細(xì)胞形態(tài)在慢病毒載體mimics陰性對照組及空白對照組和慢病毒載體pre-hsa-miR-1246 mimics組之間發(fā)生改變，由前兩組的以梭形為主變?yōu)楹笠唤M的以橢圓