AMPK對(duì)胃上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用.pdf

1、背景和目的：
　　癌癥細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤向惡性方向變化的重要標(biāo)志。大部分癌癥患者死亡并非死于原發(fā)性癌而是轉(zhuǎn)移性癌。因此，本課題利用胃癌細(xì)胞模型，深入探討癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)胃癌的治療和預(yù)后具有重要的意義。
　　上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是胚胎發(fā)育過(guò)程中的基本現(xiàn)象。它不僅參與胚胎形成與發(fā)育，同時(shí)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，TGF-β信號(hào)是EM

2、T的主要誘導(dǎo)因子之一。AMPK（單磷酸腺苷活化激酶，AMP-activited Protein Kinase）是細(xì)胞內(nèi)能量感受器，調(diào)控生物體內(nèi)能量平衡。目前關(guān)于AMPK對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的EMT及腫瘤侵襲遷移調(diào)節(jié)的的系統(tǒng)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題旨在研究AMPK對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及細(xì)胞侵襲遷移的調(diào)節(jié)作用。
　　研究方法：
　　1.胃癌組織中AMPK活性與EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)：以免疫組化技術(shù)對(duì)不同臨床

3、分期的胃癌標(biāo)本中的AMPK活性與EMT指標(biāo)的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。同時(shí)從醫(yī)院組織標(biāo)本庫(kù)冷凍保存（-86℃）的標(biāo)本中，選取16例標(biāo)本，以免疫印跡技術(shù)檢測(cè)AMPK活性和EMT指標(biāo)，分析兩者的相關(guān)性。
　　2.胃來(lái)源細(xì)胞株中AMPK活性與EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)：以免疫印跡技術(shù)在胃來(lái)源細(xì)胞株中檢測(cè)AMPK活性和EMT指標(biāo)的表達(dá)。以劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。
　　3. TGF-β誘導(dǎo)EMT的發(fā)生：以免疫印跡技術(shù)檢測(cè)在TGF-β作用SGC

4、-7901和MKN-28細(xì)胞不同時(shí)間后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，以劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞遷移能力。
　　4. AMPK抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT：以免疫印跡技術(shù)檢測(cè)二甲雙胍在作用細(xì)胞不同時(shí)間后AMPK磷酸化蛋白表達(dá)。以免疫印跡技術(shù)檢測(cè)二甲雙胍與TGF-β聯(lián)合作用細(xì)胞后EMT相關(guān)蛋白表達(dá)，以進(jìn)一步證明AMPK的激活是否能抑制EMT的發(fā)生。以劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲遷移能力來(lái)觀察AMPK對(duì)細(xì)胞生物行為學(xué)的影

5、響。
　　結(jié)果：
　　1.胃癌組織中AMPK活性與EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)：在不同臨床分期的胃癌標(biāo)本中 p-AMPK,E-cadherin隨著分期的上升而表達(dá)下降， P-smad2,Vimentin,N-cadherind隨著分期的上升而表達(dá)增加。其中p-AMPK與P-smad2,Vimentin,N-cadherin的表達(dá)負(fù)相關(guān)，與E-cadherin的表達(dá)正相關(guān)。在16例標(biāo)本中 P-smad2,Vimentin,N-cadh

6、erin的表達(dá)均高于癌旁組織，而p-AMPK,E-cadherin的表達(dá)卻在癌旁組織中高于胃癌組織。提示在胃黏膜癌變過(guò)程中p-AMPK對(duì)EMT起調(diào)節(jié)作用。
　　2.胃來(lái)源細(xì)胞株中AMPK活性與EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)：胃癌細(xì)胞株（MKN28,SGC-7901,823）中Vimentin,N-cadherin表達(dá)均低，可以篩選為誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞。
　　3. TGF-β誘導(dǎo)EMT的發(fā)生：隨著TGF-β作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸形成梭形，

7、間充質(zhì)化表型逐漸顯現(xiàn)；SGC-7901和 MKN-28細(xì)胞中間充質(zhì)特性蛋白Vimentin,N-cadherin,β-catenin表達(dá)逐漸增強(qiáng)，上皮特性蛋白E-cadheirn表達(dá)降低。
　　4. AMPK抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT：p-AMPK,p-ACC的表達(dá)隨metformin處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；Metformin與 TGF-β聯(lián)合處理細(xì)胞后，EMT間充質(zhì)性蛋白表達(dá)較TGF-β組明顯降低；劃痕實(shí)驗(yàn)中TGF-β誘導(dǎo)后細(xì)

8、胞遷移距離較長(zhǎng)，而metformin+TGF-β聯(lián)合處理后，細(xì)胞遷移距離明顯減短。Transwell實(shí)驗(yàn)中TGF-β誘導(dǎo)之后侵襲細(xì)胞數(shù)增多，而metformin+TGF-β聯(lián)合處理后，侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯降低；
　　結(jié)論：
　　1.胃癌臨床標(biāo)本中的 AMPK活性下降伴有 EMT指標(biāo)的上升，并且與胃癌轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)；提示 EMT指標(biāo)的上升與 AMPK活性有關(guān)；
　　2. AMPK被活化后，EMT表型將顯著下降，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明